Cellebiologi 06: cytoskelettet Del II: Tubulin

dette er noter fra forelæsning 6 i Harvard-udvidelsens Cellebiologikursus.

i sidste uge dækkede vi mikrofilamenter, der er lavet af actin. Denne uge: mikrotubuli, lavet af tubulin. Hvorfor spørger du, har cytoskelettet brug for to separate systemer? Overvej at mikrofilamenter kun er kæder af individuelle underenheder, mens mikrotubuli bogstaveligt talt er rør (som vi snart ser) – hule cylindre med vægge lavet af kæder lavet af dimerer. Disse forskellige strukturer betyder forskellige muligheder: mikrofilamenter kan lettere dannes spontant og kan forgrene sig (ved hjælp af Arp2/3 og andre komplekser, der blev diskuteret sidste gang) for at danne forskellige netværksformer og forbinde forskellige dele af cellen. Mikrotubuli er mere afhængige af nukleation for at danne sig og er dybest set et egernetværk, der forbinder centrosomet med cellens periferi. I praksis er mikrofilamenter rigelige i cellebarken og stærkt involveret i kontraktile bevægelser og cellemotilitet, mens mikrotubuli er mest involveret i organisering af organeller og tjener som spor til anterograd og retrograd transport.

mikrotubuli

(bruger Jeffrey81)

ud over dette er tidligere udgaver af lodish og Cooper Cell biology lærebøger tilgængelige på NCBI også fremragende referencer.

den rørformede struktur af mikrotubuli er mere robust end mikrofilamenter, hvilket tillader en masse tunge træk og skubbe. Selvom de er robuste, er mikrotubuli temperaturafhængige – de depolymeriserer, hvis de afkøles til 4 liter C og vil repolymerisere igen, hvis de opvarmes til 37 liter C, forudsat at GTP er tilgængelig.

den grundlæggende byggesten for mikrotubuli er en henholdsvis en kur-tubuilin/kur-tubulin-dimer (kodet af TUBA_-gener og TUBB_-gener). De enkelte tubulinproteiner vejer hver ~55kda, så ved ~110da / aminosyre, der er i størrelsesordenen 500 aminosyrer. Både karrus-og karrus-tubulin binder GTP, men karrusol holder stort set bare fast i det for evigt, mens det i karrusellen kan udveksles eller hydrolyseres til BNP og derefter udveksles til ny GTP igen.

strenge af på hinanden følgende liter/liter dimerer udgør protofilamenter, og 13 protofilamenter arrangeret side om side i en cylinder gør en mikrotubuli. Rummet mellem protofilamenterne kaldes en ‘søm’. Hele mikrotubuli er ~25 nm i diameter. Du kan slags se sin struktur (lavet af dimerer og protofilamenter) i det indre liv i Cellesegmentet om mikrotubuli:

inden for hver dimer er den (+) ende, begunstiget til polymerisering, og den er den (-) ende, begunstiget til depolymerisering. Mikrotubuli dannes i stort set de samme tre trin som mikrofilamenter – nucleation, forlængelse og steady state. Men i modsætning til mikrofilamenter nucleerer de ikke let alene, så nucleation kræver mikrotubuli-organiseringscentre (Mtoc ‘ er). Ikke-opdelende celler har hver kun en MTOC, kaldet centrosomet. (Dette er også afbildet i videoen ovenfor). Placeret nær kernen er centrosomet hub til en radial konfiguration af mikrotubuli med (-) ender pegede ind og (+) ender peger på celleperiferien.

centrosomet består af 2 cylindre kaldet centrioler. Hver centriol består af hver 9 sæt af 3 sideværts smeltede mikrotubuli, omgivet af et amorft ‘pericentriolært materiale’ rig på ting, der fremmer nukleering – især relur-tubulin ringkomplekser (gamma tubulin er kodet af TUBG_ generne). Karoline-tubulin betragtes som en ‘split skive’:

modellen er, at de opdelte ender tillader, at karrust-tubulin binder til karrust-tubulin – dvs. ( – ) enden af en til-være-formet mikrotubuli – tilvejebringelse af kernefrøet til dannelse af en mikrotubuli.

mikrotubuli kan dannes in vitro. Dynamikken afhænger mest af kritiske koncentrationer. (- )- Enden er mindre tilbøjelig til polymerisering end ( + ) – enden, så den har en højere kritisk koncentration. Hvis den faktiske koncentration er mellem de to Enders kritiske koncentrationer, forekommer treadmilling.

når en mikrotubuli pludselig begynder at adskille sig, kaldes dette en ‘katastrofe’. Katastrofer har nogle interessante energiske dynamikker. Husk fra tidligere, at beta-tubulin, som er den (+) ende, hvor forlængelse sker, kan være enten GTP – eller BNP-bundet. Det er en mere stabil del af dets mikrotubuli, når det er GTP-bundet; BNP-bundet tubulin er tilbøjelig til at dissociere. Mikrotubuli dannes primært ved tilsætning af GTP-bundet beta-tubulin i (+) enden, men efter tilsætning hydrolyserer beta-tubulinmolekylerne senere deres GTP og efterlader dem BNP-bundet. Så der er en slags ‘tip’ af mikrotubuli, der er GTP-bundet, mens beta-tubulin dybere ned i mikrotubuli, tilføjet længere siden, er BNP-bundet. Hvis grænsen for GTP-hydrolyse fanger op til spidsen, eller hvis der sker noget med at adskille mikrotubuli, bliver den mindre stabile, BNP-bundne beta-tubulin udsat, og protofilamenterne begynder at skrælle væk som “Rams Horn”. Hvis dette sker, vil mikrotubuli demonteres, indtil den rammer en “ø” af GTP-bundet beta-tubulin et eller andet sted længere nede i halmen. Katastrofe kan’ reddes ‘ ved tilsætning af nye GTP-bundne tubulindimerer, der vil dække enderne og stabilisere protofilamenterne, så mikrotubuli kan omformes. Du kan se i denne video, at depolymerisering af mikrotubuli kan være meget hurtigere end polymerisering:

her er nogle forbindelser, der er nyttige til at studere mikrotubuli. Colchicin, et anti-gigt-lægemiddel, binder frie alfa-beta-dimerer, hvilket reducerer deres forsyning til dannelse af mikrotubuli og dermed fremmer depolymerisering. Det er også vigtigt, at der dannes nye mikrotubuli, og fordi dannelsen af nye mikrotubuli er vigtig for mitose, er det et antineoplastisk kræftlægemiddel. Omvendt fungerer paclitaksel (taksol), et andet lægemiddel mod kræft, ved at stabilisere mikrotubuli, da nedbrydning af eksisterende mikrotubuli også er vigtig for mitose.

mikrotubuli-associerede proteiner (kort) har forskellige roller. Bemærkelsesværdigt er MAP4 (I ikke-neuronale celler), MAP2 (i neuroner) og Tau (i neuroner; kodet af MAPT gen). Alle disse har det til fælles, at de virker for at stabilisere mikrotubuli, der skifter kinetikken til fordel for mikrotubuli vækst og mod katastrofe. Hver indeholder en 18 aminosyrestrækning med positivt ladede aminosyrer, der binder til den negative del af mikrotubuli. De kan virke for at bundte flere mikrotubuli sammen , hvor MAP2 holder mikrotubuliene i større afstand på grund af dens længere arm (sammenlignet med Tau).

kortene reguleres af phosphorylering: MARKPROTEINKINASERNE binder kovalent fosfatgrupper til S, T eller Y aminosyrer i MAP-proteinerne, hvilket reducerer deres evne til at binde mikrotubuli. (Cyclinafhængige kinaser regulerer også kortene under mitose). Det menes, at disse kort virker for at bestemme cellernes fysiske struktur. I neuroner findes MAP2 i dendritter, og Tau er for det meste i aksonet. Mutationer i MAPT-genet, der koder for Tau, forårsager frontotemporal demens (FTD). Hyperphosphoryleret Tau findes (selvom vi ikke ved hvorfor) i patienternes hjerner. Musemodeller af begge disse sygdomme viser aksonal degeneration , i overensstemmelse med at Tau ikke er i stand til at gøre sit job med at stabilisere mikrotubuli i aksonet.

en anden klasse af proteiner, der hedder +Tips til deres binding til (+) slutningen af mikrotubuli, kan beskytte mod katastrofe. De ser ud til at udvide en retfærdig vej ned i mikrotubuli. Denne video viser, at EB-1 skubbes udad, fordi enderne af mikrotubuli vokser:

andre endebindende proteiner fremmer katastrofe snarere end stabilitet. Kinesin – 13 virker til at kurve slutningen af protofilamenterne og sænke tærsklen for katastrofe. Stathmin (STMN1-gen; aka op18, hvor op står for oncoprotein) binder til tubulindimerer i et protofilament, hvilket fremmer både øjeblikkelig katastrofe og muligvis også GTP-hydrolyse, som ved at fjerne “øer” af GTP-bundet beta-tubulin ville repræsentere mere af en langsigtet investering til fordel for katastrofe. Stathmin reguleres af phosphorylering. Katanin (efter det japanske sværd katana) skærer bogstaveligt talt mikrotubuli.

Mikrotubulemotoriske proteiner ligner stort set mikrofilamentmotoriske proteiner. De kommer i to familier: kinesiner, hvoraf de fleste bevæger sig anterograd dvs.mod (+) enden; og dyneins, hvoraf de fleste bevæger sig retrograd dvs. mod (-) enden. De’ går ‘ sådan:

Kinesin og dynein er involveret i bevægelige organeller, endocytose og eksocytose og kromosomsegregering under meiose & mitose.

Kinesin-1, den bedst studerede af kinesinerne, er en ‘konventionel’ kinesin, idet den fungerer som en tetramer sammensat af to tunge kædeenheder (KIF1-gener f. eks. KIF1A), der omfatter ‘hoved’ – domænerne, der hydrolyserer ATP og binder mikrotubuliene, og to lette kædeenheder (KLC-gener f.eks. KLC1), der omfatter en ‘hale’, der binder lasten, i dette tilfælde vesikler. Et linkerdomæne (hvilket protein er denne del af?) muliggør dimerisering af to tunge kæder.

her er en video af det i aktion. Bemærk, at videoen kalder det en dimer i stedet for en tetramer; jeg tror, det er fordi de kun overvejer hovederne og ikke diskuterer halerne.

nogle af de andre kinesiner adskiller sig lidt:

• Kinesin-2, som også gør vesikel & organeltransport, er en heterotrimer med to forskellige (dog beslægtede) tunge kæder og et andet polypeptid, det bruger til at regulere sin last.
• Kinesin-5 har hoveder i begge ender i stedet for et hoved og en hale, så det går i modsatte retninger på to forskellige mikrotubuli og trækker dem sammen. Dette kaldes ‘bipolar bevægelse’.
• Kinesin-14 er det eneste kendte kinesin, der bevæger sig mod (-) enden, og det er involveret i mitose.

principperne for den ‘gående’ bevægelse er dog stort set de samme for alle kinesinerne og er det, der er afbildet i den sidste video ovenfor. Når de ikke er bundet til en mikrotubuli, er ‘hovederne’ begge ADP-bundne. Et hoved vil tilfældigvis støde på en mikrotubuli og binde sig til den og frigive dens ADP, så en ATP kan erstatte den. ATP-bindingen inducerer konformationsændring, der trækker på linkeren, svinger det andet, ‘halter’ hoved fremad i førende position, hvor det binder til mikrotubuli. Det originale hoved hydrolyserer derefter ATP, der frigiver fosfat (som forkortes som Pi i videoen) og giver energien til det ene energisk op ad bakke i denne proces, der bryder væk fra mikrotubuli.

Myosin (det motoriske protein, der går på mikrofilamenter) og kinesin har meget lignende strukturer, men ingen aminosyresekvenslighed. Således menes de ikke at være paralogs, men snarere et eksempel på konvergent evolution.

folk taler meget om kinesiner dels fordi vi ikke forstår dyneins helt så godt. Dyneins er enorme proteiner, der er lavet af 2 store, 2 mellemliggende og 2 små underenheder. Deres store størrelse har gjort dem vanskelige at isolere og karakterisere, og deres arbejde er ikke godt forstået. Vi ved, at dynactinkomplekset (et multiproteinkompleks; dynactinerne selv er dtcn_-generne) er involveret som en ‘adapter’, der forbinder dynein med last.

denne video opsummerer hele cytoskelettet og reb i meget af materialet fra sidste uge og dette foredrag:

PrP

som nævnt i sekretoriske vejnoter er PrP GPI-forankret til membranen og gennemgår endocytose meget regelmæssigt og skaber endocytiske vesikler med PrP i dem. Encalada 2011 finder ud af, at Kinesin-1c og DHC1 (dynein heavy chain 1) er ansvarlige for at transportere disse PrP vesikler henholdsvis anterograd og retrograd. Når Encalada slået ud, slået ned eller hæmmet Kinesin-1C, anterograd og retrograd bevægelse blev reduceret, og tilsvarende når DHC1 blev afbrudt. Så det ser ud til, at disse to komplekser, selvom de bevæger sig i modsatte retninger, aktiverer hinanden. Og interessant nok forhindrede forstyrrelsen af disse motorproteiner ikke PrP – vesikler i at forbinde med motorer-de bevægede sig bare ikke så hurtigt eller så ofte. Papiret har en række andre cellebiologiske konklusioner om arten af, hvordan vesikler aktiverer motoriske proteiner, og hvordan transportretningen bestemmes.