Clostridium difficile toksin B

når den katalytiske threoninrest af glucosyltransferase deaktiverer en familie af små gtpaser,f.eks. Rho-familien; Rac og Cdc42 inde i målcellerne forstyrrer signaltransduktionsmekanismer, hvilket fører til dysfunktion af actincytoskelet, celle-celleforbindelse og apoptose (Fig. 5). Rho inducerer aktiviteten af actinspændingsfibre. Rac proteiner styrer aktiviteterne af membran ruffling og NADPH-oksidase neutrofile. Cdc42 regulerer f-actinfilamentdannelsen i filopodia.

Cytotoksicitetrediger

flere undersøgelser har vist, at tilstedeværelsen af TcdB i pattedyrceller fører til hurtige ændringer inden for cellemorfologi og cellesignalering. Inden for en kort periode har cellerne udseende af plak med små doser af TcdB og TcdA. Derudover er cellernes død en stor indvirkning af disse toksiner, efter at cellerne er blevet Beruset. En undersøgelse foretaget af Donta et al., videresendt, at TcdB har alvorlige virkninger i andre pattedyrceller, såsom ovarieceller fra kinesisk hamster, humane cervikale epitelceller, Muse-binyreceller, rotte-hepatocytter og rotte-astrocytter (Fig.3).

den cytotoksiske aktivitet er baseret på celletyper, som kan variere fra 4 gange til 200 gange. Generelt, når celler er inficeret med TcdB, mister de ikke kun deres strukturelle integritet, men også formindskelser af F-actinfilamenter. Celleafrundinger af TcdB tager ikke længere end 2 timer (Fig. 4), men så vidt celledød går, kan det tage cirka 24 timer. Med hensyn til Clostridium difficile-associeret diarre (CDAD) er virkningerne af cytopaticitet mere kritiske end faktisk celledød, fordi når celler mister integriteten af cytoskelet actinfilamentet, mister de også sin normale funktion.

effekter på små GTPasesEdit

årsagen til cytotoksisk aktivitet af TcdB i værtscellen medieres hovedsageligt via receptorendocytose. Sure endosomer tillader toksin B at komme ind i cytosolen. Dette fænomen finder sted ved en bindende receptorregion, som gør det muligt for toksin at komme ind i værtsceller. Gennem tilgængeligheden af værtscellernes cytosol deaktiverer TcdB de små Gtpaser (Fig. 5), f.eks. Rho-familiemedlemmerne Rac og Cdc42 ved glycosylering af threonin 35 i Cdc42 og Rac og threonin 37 i Rho. Disse Rho Gtpaser findes allestedsnærværende i cytosolen af eukaryote celler, der er ansvarlige for organiseringen af actincytoskelettet, fordi toksinerne i cytosolen forårsager kondensering af actinfilamenter som en konsekvens af cellerunding og membranblebbing (Fig. 3), hvilket i sidste ende fører til apoptose. TcdB forårsager kritiske ændringer i celledynamik og morfologi. Figur 3 viser den sandsynlige virkning af toksin B på en celles overflade; membranblebbing (sorte pile). Derudover inaktiverer TcdB Rho Gtpaser. Som følge heraf forstyrres cellecelleforbindelser, hvilket forbedrer epitelpermeabiliteten af toksin B og væskeakkumulering i lumen. Dette er et af de vigtigste årsagsmidler til at indgå Clostridium difficile-associeret diarre (CDAD)(Fig. 5).

Endvidere er hastigheden af hydrolyse af TcdB af UDP-glucose ca.fem gange større end TcdA. Flere undersøgelser har vist, at Rho udviser posttranslationel modifikation gennem prenylering og carboksymethylering, som forekommer i den cytoplasmatiske side af plasmamembranen, dermed udveksling af GTP til BNP. Når TcdB binder til Rho og andre små Gtpaser, hydrolyserer GTP til BNP, hvilket fører til GTP-bundet (aktiv) til BNP-bundet (inaktiv) (Fig. 5). Derudover reguleres denne udvekslingsaktivitet af guaninfaktorer i cellens cytosol.

forstyrrelse på signalvejeredit

den cellulære regulering af Rho, Rac og Cdc42 har virkninger uden for nærheden af actinfilamenterne i cytoskelettet (Fig. 4), er disse små Gtpaser inkorporeret i cellecyklussen, der regulerer signaler via mitogenaktiverede proteinkinasekinaser (MAPKKs). Nogle fysiologiske dele af cellerne, der ikke er involveret i actinfilamenter, forårsager muligvis ikke cellerunding eller celledød med det samme, men i nedstrøms vejaktivitet kan det føre til forringelse af actinfilamenter og endelig celledød.

i 1993 blev en undersøgelse foretaget af Shoshan et al., viste, at celler med TcdB ændrede phospholipase A2-aktivitet. Dette var en uafhængig begivenhed fra forstyrrelse af actin-cytoskelettet. Shoshan et al., viste også, at TcdB inhiberede receptorsignaleringsaktiviteten ved at deaktivere Rho-proteinerne via phospholipase D.

Poredannelseredit

TcdB får adgang til det indre af cellen gennem clathrin-medieret endocytose, når toksin B er en del af cytosolen, passerer glucosyltransferasen gennem den endosomale membran, hvilket nedsætter pH, inducerer translokation og til sidst fører til morfologiske ændringer af translokationsregionrester (958-1130). De hydrofobe regioner er indlejret i værtsmembranen for at danne porer, der tillader glucosyltransferase-domæner at passere igennem. Når celler inficeres med TcdB i et surt miljø, dæmper det toksiner og forårsager formomlejringer (Fig. 6). Som en konsekvens af sur pH viser TcdB klare forskelle i original fluorescens af tryptophan, modtagelighed for proteaser og hydrofobe overflader. En anden gruppe har vist, at forsuring fører til konformationsændringer af toksinet og, endnu vigtigere, hjælper med at danne porer. En formodet translokationsregion (Fig. 2) udgør cirka 801-1400 aminosyrer, hvoraf rester 958-1130 er hydrofobe og er ansvarlige for dannelsen af transmembrane porer. Et flertal af undersøgelserne anvendte TcdB stamme 630 til at vise poredannelsesaktiviteten af C. difficile toksiner.

induceret af pHEdit

for at se, om virkningerne af proteolytisk spaltning af TcdB finder sted ved celleoverfladen eller i sure endosomer, anvendte undersøgelser bafilomycin A1, som vides at blokere v-type H+-atpaser af endosomer. Dette reducerer surheden i endosomer. Den fysiologiske optagelsesvej for TcdB forhindrer cytopatisk aktivitet af TcdB. Når cellerne var i sure forhold (pH 4,0) i 5 minutter efter binding af TcdB til celleoverfladen ved 37 grader Celsius, blev formomlejringerne og afrundingen observeret. Når afrundede celler imidlertid blev inkuberet i en yderligere time i neutral pH (7,0) med lignende parametre, blev der ikke observeret nogen cellerunding. Begge undersøgelser viste, at toksin B har en egenskab af proteolytisk spaltning, hvilket er kritisk for adgang til cytosolen. At have en sur endosoms pH fører til topologiske ændringer af TcdB (figur 6).

Genetikrediger

genet, der koder for TcdB-proteinet, tcdB, er placeret inden for det kromosomale område på 19,6 kb. Dette er kendt som locus for patogenicitet eller PaLoc (figur 2). Den åbne læseramme (ORF) for tcdB er 7.098 nukleotider i længden. Det er vigtigt at nævne, at der—udover de største toksingener i PaLoc—regionen-er tre andre tilbehørsgener, der koder i PaLoc-regionen: tcdR (L), tcdC (R) og tcdE i midten. Disse gener hjælper med at regulere tcda og TcdB-ekspression. De hjælper også med at udskille eller frigive toksinerne fra cellen. Det kodende gen tcdE, placeret mellem tcdB og tcdA, er analogt med holinproteiner, således foreslås det, at tcdE fungerer som et facilitatorgen, der forbedrer frigivelsen eller sekretionen af TcdA og TcdB, hvilket følgelig øger permeabiliteten af værtscellemembranen.

toksin detektionredit

der er forskellige plasmidstørrelser af C. difficile. De detekterede molekylvægte varierer fra 2, 7h106 til 100h106, men plasmidstørrelser viser ingen sammenhæng med toksicitet. For at detektere toksin B-niveauet i C. difficile, klinikere bruger i vid udstrækning cellekulturanalyser afledt af afføringsprøver fra patienter med PMC. Cellekulturanalysen betragtes som en” guldstandard ” til påvisning af toksicitet i C. difficile, fordi en lille mængde toksin B er i stand til at forårsage celleafrunding (Fig. 4), er det således en stor fordel ved kliniske laboratorier at foretage korrelationer med CDAD forårsaget af TcdB. Selvom cytotoksisk aktivitet af store clostridiale toksiner (LCT ‘ er) blev fundet i PMC-afføringsprøver, havde toksin B-aktivitet mere skadelige cytotoksiske virkninger sammenlignet med toksin A. Derfor dæmpes aktiviteten af toksin A, når den ikke isoleres fra toksin B. påvisningen af C. difficile toksicitet er ekstremt følsom, men ved hjælp af cellekulturanalysen tillader kliniske laboratorier at overvinde udfordringen; brug af doser så lidt som 1 pg/mL toksin B er nok til at forårsage celleafrunding. Dette er den største fordel ved at bruge kulturvævsanalysen til at detektere toksicitet hos PMC-patienter. Selvom kliniske laboratorier har forsøgt at bruge en assay mikrotiterplade immunosorbentassay (ELISA) og andre teknikker til at detektere den cytotoksiske aktivitet af toksin B i fæces hos PMC-patienter, resultaterne er ikke så nøjagtige som dem, hvor cellekulturanalyser blev anvendt.

Produktionsfaktorredit

ved tilsætning af antimikrobielle stoffer, f. eks. clindamycin, i kulturvækstmediet, har undersøgelser vist, at den cytotoksiske aktivitet i C. difficile kulturer stiger med 4-8 gange. Desuden at kende rolle antibiotika på årsagerne til PMC, mange tidligere undersøgelser fokuseret på virkningerne af antimikrobielle stoffer produktion af toksiner. Som et resultat var undersøgelser i stand til at konkludere, at den subinhiberende karakter af vancomycin og penicillinniveauer øgede toksinproduktionen i kulturer af C. difficile. Mængderne af toksinproduktion var korreleret med brugen af vækstmedium til organismerne. En anden undersøgelse illustrerede, at de høje niveauer af toksinproduktion af TcdB blev observeret i komplekse medier såsom hjerne-og hjerteinfusionsbuljong. Høje niveauer af toksiner blev produceret med isolering af stærkt virulente. Omvendt blev lave niveauer af toksiner produceret med isolering af svagt virulent. Det viser således, at produktionen af toksiner blev co-reguleret. Selvom mekanismen bag miljøets involvering i modulering af signalerne, der udtrykker toksinerne, ikke forstås, har in vitro-undersøgelser vist, at ekspression af toksin styrkes af katabolitundertrykkelse og stress, f.eks. antibiotika. En anden undersøgelse har vist, at begrænsning af biotin i velkarakteriseret medium øger produktionen af TcdB med 64 gange og TcdA med 35 gange. Dette blev gjort med C. difficile og doser af biotin så små som 0,05 nM. Flere andre tidlige undersøgelser har argumenteret imod teorien om, at produktionen af toksin har noget at håndtere stress eller katabolit undertrykkelse af enten toksin TcdA eller TcdB. Mange undersøgelser siger også, at hovedårsagen til forskellene blandt andre undersøgelser skyldes, at toksinproduktion ikke forekommer med alle isolater af C. difficile.