Čištění bílkovin
volba výchozího materiálu je klíčem k návrhu procesu čištění. V rostlině nebo zvířeti, konkrétní protein obvykle není distribuován homogenně v celém těle; různé orgány nebo tkáně mají vyšší nebo nižší koncentrace proteinu. Použití pouze tkání nebo orgánů s nejvyšší koncentrací snižuje objemy potřebné k produkci daného množství purifikovaného proteinu. V případě, že protein je přítomen v nízké množství, nebo jestli to má vysokou hodnotu, vědci mohou pomocí rekombinantní DNA technologie k vývoji buňky, které budou produkovat velké množství požadovaného proteinu (toto je známé jako vyjádření systému). Rekombinantní exprese umožňuje, aby byl protein označen, např. his-tagem nebo Strep-tagem, aby se usnadnilo čištění, čímž se sníží počet požadovaných čisticích kroků.
analytické čištění obecně využívá tři vlastnosti k oddělení proteinů. Za prvé, proteiny mohou být čištěny podle jejich izoelektrických bodů tím, že je vedou gelem se stupněm pH nebo iontoměničovou kolonou. Za druhé, proteiny mohou být odděleny podle jejich velikosti nebo molekulární hmotnost přes velikost vyloučení chromatografie nebo pomocí SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfát-polyakrylamidovém gelu elektroforéza) analýzy. Proteiny jsou často purifikovány pomocí 2D-PAGE a poté jsou analyzovány pomocí peptidových masových otisků prstů, aby se stanovila identita proteinu. To je velmi užitečné pro vědecké účely a limity detekce pro proteiny jsou dnes velmi nízké a nanogram množství bílkovin je dostatečné pro jejich analýzu. Za třetí, proteiny mohou být odděleny polaritou / hydrofobitou pomocí vysoce výkonné kapalinové chromatografie nebo chromatografie s obrácenou fází.
protokol čištění proteinů obvykle obsahuje jeden nebo více chromatografických kroků. Základním postupem v chromatografii je proudit roztok obsahující protein kolonou naplněnou různými materiály. Různé proteiny interagují jinak s sloupce materiálu, a může tak být oddělen od času musí projít kolonou, nebo podmínky, které musí eluovat proteinu z kolony. Obvykle jsou proteiny detekovány, když vystupují z kolony svou absorpcí při 280 nm. Mnoho různých chromatografické metody existují:
Velikost vyloučení chromatographyEdit
Chromatografie může být použita k oddělení bílkovin v roztoku nebo denaturace podmínky pomocí porézní gely. Tato technika je známá jako chromatografie s vyloučením velikosti. Princip spočívá v tom, že menší molekuly musí procházet větším objemem v porézní matrici. Proto, proteiny určitý rozsah ve velikosti, bude vyžadovat variabilní objem eluentu (rozpouštědlo), než budou shromážděny na druhém konci sloupce gelu.
v souvislosti s purifikací proteinů se eluent obvykle sdružuje do různých zkumavek. Všechny zkumavky, které neobsahují měřitelnou stopu proteinu k čištění, se zlikvidují. Zbývající roztok je tedy vyroben z proteinu pro čištění a dalších podobně velkých proteinů.
Separace na základě náboje nebo hydrophobicityEdit
Hydrofobní interakce chromatographyEdit
HIC médií je amfifilní, jak s hydrofobní a hydrofilní regionů, což umožňuje separaci proteinů na základě jejich povrchové hydrofobicity. Cílové proteiny a jejich agregované druhy produktů mají tendenci mít různé hydrofobní vlastnosti a jejich odstranění pomocí HIC dále čistí požadovaný protein. Navíc použité prostředí obvykle používá méně drsné denaturační podmínky než jiné chromatografické techniky, což pomáhá zachovat protein zájmu v jeho přirozeném a funkčním stavu. V čisté vodě, interakce mezi pryskyřice a hydrofobní oblasti proteinu by bylo velmi slabé, ale tato interakce je zvýšena použitím proteinového vzorku HIC pryskyřice při vysoké iontové síle pufru. Iontová síla pufru se pak redukuje na eluční proteiny v pořadí klesající hydrofobicity.
iontoměničová chromatografieeditovat
iontoměničová chromatografie odděluje sloučeniny podle povahy a stupně jejich iontového náboje. Sloupec, který má být použit, je vybrán podle typu a síly náboje. Anionovými mají kladný náboj a jsou používány k udržení a oddělit záporně nabité sloučeniny (anionty), zatímco kationtová výměnná pryskyřice mají záporný náboj a jsou používány k samostatné pozitivně nabité molekuly (kationty).
před zahájením separace je pufr čerpán kolonou, aby se vyrovnaly protilehlé nabité ionty. Po injekci vzorku se molekuly rozpuštěné látky vymění s pufrovými ionty, protože každá soutěží o vazebná místa na pryskyřici. Délka retence pro každou rozpuštěnou látku závisí na síle jejího náboje. Nejslabší nabité sloučeniny se nejprve eluují, následované těmi, které mají postupně silnější náboje. Vzhledem k povaze separačního mechanismu, pH, Typ pufru, koncentrace pufru a teplota hrají důležitou roli při řízení separace.
iontoměničové chromatografie je velmi mocný nástroj pro použití v čištění proteinů a je často používán jak v analytické a preparativní separace.
volný průtok-elektroforézaeditovat
Free-flow electrophoresis (FFE) je dopravce-zdarma elektroforéza technika, která umožňuje preparativní separace proteinů v laminárním vyrovnávací proud pomocí ortogonální elektrické pole. Tím, že použití pH-gradientu, který může být například vyvolán ampholytes, tato technika umožňuje oddělit protein izoformy až do rozlišení < 0.02 delta-pí.
afinitní chromatografieeditovat
Afinitní Chromatografie je separační technika založená na molekulární konformaci, která často využívá aplikačně specifických pryskyřic. Tyto pryskyřice mají ligandy připojené ke svým povrchům, které jsou specifické pro sloučeniny, které mají být odděleny. Nejčastěji tyto ligandy fungují podobným způsobem jako interakce protilátka-antigen. Tento „zámek a klíč“ fit mezi ligandem a jeho cílová sloučenina je vysoce specifické, často vytváří jeden vrchol, zatímco všechny ostatní ve vzorku je nezadržovaných.
mnoho membránových proteinů jsou glykoproteiny a mohou být čištěny lektinovou afinitní chromatografií. Detergentem solubilizované proteiny se mohou vázat na chromatografickou pryskyřici, která byla upravena tak, aby měla kovalentně připojený lektin. Proteiny, které se nevážou k lektin jsou odplaveny a pak specificky vázané glykoproteiny mohou být eluován přidáním vysoké koncentrace cukru, která konkuruje vázané glykoproteiny na lektin vazebné místo. Některé lektiny vysokou afinitu vazby na oligosacharidy glykoproteinů, že je těžké soupeřit s cukry a vázané glykoproteiny muset být propuštěn denaturaci lektin.
Imunoafinitní chromatografieeditovat
Imunoafinitní chromatografie používá specifickou vazbu protilátky-antigenu k selektivnímu čištění cílového proteinu. Postup zahrnuje imobilizaci proteinu na pevný substrát (např. porézní korálek nebo membrána), který pak selektivně váže cíl, zatímco vše ostatní protéká. Cílový protein může být eluován změnou pH nebo slanosti. Imobilizovaný ligand může být protilátka (jako je imunoglobulin G) nebo může být protein (jako je Protein a). Protože tato metoda nezahrnuje inženýrství ve značce, může být použita pro proteiny z přírodních zdrojů.
Čištění tagged proteinEdit
Další způsob, jak označit proteiny je inženýr antigen peptid tag na bílkoviny, a pak očistit bílkovin na sloupec nebo inkubací s volným pryskyřice, která je potažené imobilizované protilátky. Tento konkrétní postup je znám jako imunoprecipitace. Imunoprecipitace je docela schopná generovat extrémně specifickou interakci, která obvykle vede k vazbě pouze požadovaného proteinu. Vyčištěný označené proteiny pak mohou být snadno odděleny od ostatních proteinů v roztoku a později eluovány zpět do čisté řešení.
když značky již nejsou potřeba, mohou být odštěpeny proteázou. To často zahrnuje inženýrství štěpného místa proteázy mezi značkou a proteinem.
HPLCEdit
vysokoúčinná kapalinová chromatografie nebo vysokotlaké kapalinové chromatografie je forma chromatografie s použitím vysokotlaké řídit rozpuštěných látek přes kolony rychleji. To znamená, že difúze je omezená a rozlišení je zlepšeno. Nejběžnější formou je“ obrácená fáze “ HPLC, kde je materiál sloupce hydrofobní. Proteiny jsou eluovány gradientem rostoucího množství organického rozpouštědla, jako je acetonitril. Proteiny eluují podle své hydrofobnosti. Po čištění HPLC je protein v roztoku, který obsahuje pouze těkavé sloučeniny a může být snadno lyofilizován. HPLC purifikaci často za následek denaturaci čištěné bílkoviny a je tedy použitelné pro proteiny, které nejsou spontánně znovu složte.