Žluč-Eskulin Test pro Presumptivní Identifikaci Enterokoků a Streptokoků: vliv Koncentrace Žluči, Očkování Technika, a Inkubační Doba

Uznání a diferenciace kataláza-negativní, alfa-hemolytické a nonhemolytic gram-pozitivní koky ve dvojicích a řetězy jako enterokoky, skupina D streptokoků (mainlyStreptococcus bovis); a non-skupiny D viridans skupina streptokoky jsou klinicky významné (10). Žluč-eskulin test je široce používán k odlišení enterokoků a skupina D streptokoků, které jsou žlučové tolerantní a může se rozpouštějí eskulin, aby esculetin, od non-skupina D viridans skupina streptokoky, které rostou špatně na žluč. Jako první popsal v roce 1926 Meyer a Schonfeld (8), žluč-eskulin testu bylo prokázáno Facklam a Moody (2, 3, 5) mají senzitivitu 100% a specificitu 97% pro identifikaci enterokoků a skupina D streptokoků. Tyto výsledky byly získány s šikmých agarů obsahujících 4% oxgall (soli žlučových kyselin), naočkována s 1 nebo 2 kapky na 24-h Todd Hewitt obě kultury organismu („příští den“, očkování), a inkubovány po dobu 48 h. V rutinní diagnostické bakteriologii, jako protokol, je nepraktické, protože to vyžaduje 3 dnů od okamžiku, kdy kolonie jsou detekovány na základní desky. Většina učebnic a řízení příručky doporučují očkovat šikmých agarů přímo od několika kolonií („same-day“, očkování), spíše než z 24-h subkultury ve vývaru, ale data podporující tento nonstandardized alternativní technika chybí.

Proto jsme hodnotili citlivost a specifičnost žluč-eskulin test s dva různé způsoby stejný den očkování (standardizované a nonstandardized) a dvou různých inkubačních časů (24 a 48 h). Také jsme ve srovnání eskulin svažuje obsahující 2 a 4% oxgall ve formulacích v současné době k dispozici ze dvou hlavních komerčních zdrojů ve Spojených Státech.

Kataláza-negativní, gram-pozitivní koky ve dvojicích a řetězy tvoří alfa-hemolytické nebo nonhemolytic kolonie na 5% ovčí krve, agar, které byly pozitivní pro PYR (Murex, Dartford, Spojené Království) a rostl v tryptic soy broth obsahující 6.5% NaCl (Becton Dickinson Mikrobiologie Systémy , Cockeysville, Md.) byly identifikovány jako enterokoky; byly specifikovány systémem API Rapid Strep (bioMérieux Vítek, Hazelwood, Mo.). Kataláza-negativní, gram-pozitivní koky ve dvojicích a řetězy tvoří alfa-hemolytické nebo nonhemolytic kolonie, které byly negativní na PYR, ani růst ve výši 6,5% NaCl, byly pozitivní pro skupinu D antigenu pomocí latexové aglutinace (Murex) a sugestivní (≥90% pravděpodobnost) biochemické vzor API Rychlý Strep systému byly identifikovány jako S. bovis. Kataláza-negativní, gram-pozitivní koky ve dvojicích a řetězy tvoří alfa-hemolytické nebo nonhemolytic kolonie, které byly negativní na PYR a skupina D antigen (a jsou nerozpustné ve žluči pokud alfa-hemolytické) byli povoláni viridans skupina streptokoky.

celkem 110 enterokokových kmenů (34 Enterococcus faecalis, 15 Enterococcus faecium, a 61 nonhemolytic a nonspeciated kmeny), 30. S. bovis kmeny (2 alfa-hemolytické a 28 non-hemolytické kmeny), a 110 non-skupina D viridans skupina streptokokové kmeny (83 alfa-hemolytické a 27 nonhemolytic kmenů) byly testovány. Kmeny byly izolovány následně z krevních kultur provedené na Duke University Medical Center během 4-leté období, s výjimkou 19 S. bovisstrains, které byly získány z Mayo Clinic.

Čerstvé (24-h) bakterie byly naočkovány na třech různých eskulin šikmých agarů obsahujících buď žádné žluči (BDMS), 2% oxgall (ekvivalent k 20% žluči) (BDMS), nebo 4% oxgall (ekvivalent k 40% žluči) (Remel, Lenexa, Kans.). Kromě oxgallu byly skladby tří médií stejné. Pro každé médium, následující dvě očkování techniky byly použity: (i) přímé, nonstandardized S-tvarované očkování od 1 do 10 kolonií a (ii) nepřímé, standardizované inokulace 10 µl (kalibrované smyčky) 0,5 McFarland standardní suspenze bakterií ve sterilní deionizované vody. Sklon písma byly inkubovány při 35°C v okolním vzduchu (2) s volnými čepice pro 48 h. Naměřené hodnoty byly odebrány po 24 a 48 h. Reakce byla považována za pozitivní, když jeden-polovina nebo více středně byl zčernalé (4).

S jednou výjimkou, všechny 110 enterokokových kmenů dal jasný pozitivní reakce po 24 a 48 hodinách inkubace (99% citlivost). Standardizované inokulum (přibližně 106 CFU) bylo stejně citlivé jako těžší, nestandardizované inokulum. Facklam a Náladový, s použitím inokula 107 až 108 CFU na šikmých agarů, uvádí citlivost 100% na 48 hodin, ale našel 2 76 (5) a 6 157 (3) enterokokových kmenů k žluč-eskulin negativní (98% citlivost) po 24 h inkubace. Swan (13), za použití nestandardizovaného inokula popsaného jako těžké i agarové destičky, na nichž bylo jakékoli zčernání považováno za pozitivní výsledek, získal citlivost 100% za 24 hodin u 121 enterokokových kmenů. Nicméně, na základě Facklam publikací, většina učebnic a řízení příručky doporučují, inkubace 48 h před vykazování negativní výsledek.

všech 30 kmenů s.bovis bylo pozitivních po 24 a 48 hodinách bez ohledu na koncentraci žluči nebo metodu inokulace (100% citlivost). Facklam (3) hlásil citlivost 94 a 100% při 24 a 48 h u 37 streptokokových kmenů skupiny D.

Tabulka 1 znázorňuje procentní podíl falešně pozitivní žluč-eskulin testy pro 110 non-skupina D viridans skupina streptokokové kmeny. Zjistili jsme, že specificita (100% mínus procento falešně pozitivní) byl maximální (97%) se standardizovaným inokulem melír na šikmých agarů obsahujících 4% oxgall a číst po 24 h. Falešně pozitivní výsledky byly získány s dvěma Streptococcus milleriand jeden Streptococcus lactis subsp. diacetylaktisstrains. Nedostatek standardizace inokula, snížení koncentrace oxgall na 2%, a prodloužení inkubační doba 48 h zvýšil počet falešných poplachů na maximálně 24%. V předchozích studiích s selektivní esculin agar obsahující azid sodný a pouze 10% žluči, pozitivní reakce s non-skupina D viridans skupina streptokoky byly časté (6, 11, 12). Dříve nebyly zveřejněny žádné údaje o použití média obsahujícího 2% oxgall. Naše výsledky naznačují, že tato koncentrace je neoptimální. Pomocí 4% oxgall, Labuť (13) zjistili dva žlučové-tolerantní viridans skupina streptokokové kmeny z 21 izolátů, ani napětí, nicméně, hydrolyzují eskulin na 24 h. Facklam et al. hlášená specifika 99% při 24 h (3) a 81 (4) až 97% (3) při 48 h S 4% oxgall.

výrazný rozdíl byl nalezen při podskupin alfa-hemolytické a nonhemolytic non-skupina D viridans skupina streptokoky byly ve srovnání na počet falešných poplachů. Pro alfa-hemolytické kmeny, toto číslo bylo 0% po 24 h a 3% po 48 h, vzhledem k tomu, že pro nonhemolytic kmenů to bylo 11% po 24 h a 33% po 48 h, s 4% oxgall a standardizované inokulum (P = 0.017 pro 24-h hodnoty; oboustranný Fisherův exaktní test). Takové pozorování nebylo dříve hlášeno.

Pro vzorky jiné než krevní a normálně sterilních míst, vývojový diagram, založený na žluč-eskulin test v kombinaci s 6,5% NaCl tolerance nebo přítomnost PYR je dostatečná pro spolehlivé identifikace enterokoků. Žluč-esculin-pozitivní organismy z krve a normálně sterilních míst by měly být specifikovány. Speciace enterokoků je užitečná z epidemiologických důvodů a protože E. faecium a další druhy mají tendenci být odolnější vůči antibiotikům než e. faecalis (8, 9). Definitivní identifikace ofS. bovis je důležitý, protože organismus je spojen s karcinomem tlustého střeva, což by mělo být u těchto pacientů vyloučeno (7). Na druhé straně falešně pozitivní zprávy ofS. bovis může vést ke zbytečným vyšetřením. Speciace organismů pozitivních na žluč-esculin také umožní detekci falešně pozitivních streptokoků skupiny D viridans. Terapeutické chyby mohou nastat při nesprávné identifikaci streptokoků a enterokoků (1). Rutinní speciace žluč-esculin-negativních organismů není nutná, protože enterokoky a streptokoky skupiny D zřídka způsobují falešně negativní reakce.

Na závěr, žluč-eskulin test funguje dobře, rychle oddělit enterokoky a skupina D streptokoků z non-skupina D viridans skupina streptokoky za nízkou cenu a s dobrou citlivostí (>99%) a specificitu (97%), za předpokladu, že je provedena na šikmých agarů obsahujících 40% žluči, provádí se standardizované inokulum (10 µl 0,5 McFarland standardní bakteriální suspenze), a číst na 24 h.