Clostridium difficile toxin B
Když katalytické threonin reziduí glucosyltransferase deaktivuje rodině malé GTPases,např. Rho rodiny, Rac a Cdc42 uvnitř cílové buňky rušit přenos signálu mechanismy, což vede k dysfunctioning z aktin cytoskeletu, buňky-buněčné spojení, a apoptózy (Obr. 5). Rho indukuje aktivitu aktinových stresových vláken. Rac proteiny řídí činnost membrána čechral a NADPH-oxidáza neutrofilů. Cdc42 reguluje tvorbu F-aktinových vláken ve filopodii.
Cytotoxicityeditovat
obrázek 3: Toxin B mění dynamiku buněčné struktury. Obrazy SEM: a) kontrolní buňky a b) buňky ošetřené TcdB po dobu 18 hodin. Černá šipka označuje umístění blebování povrchu buňky.
Několik studií prokázalo, že přítomnost TcdB v savčích buňkách vede k rychlým změnám v morfologii buněk a buněčné signalizace. Během krátké doby mají buňky vzhled plaku s malými dávkami TcdB a TcdA. Kromě toho je smrt buněk hlavním dopadem těchto toxinů poté, co byly buňky intoxikovány. Vyšetřování Donta et al., předáno, že TcdB má vážné dopady na jiné savčí buňky, jako jsou ovariální buňky čínského křečka, lidské cervikální epiteliální buňky, myší nadledviny, hepatocyty potkanů a astrocyty potkanů (obr.3).
cytotoxická aktivita je založena na typech buněk, které se mohou pohybovat od 4násobku do 200násobku. Obecně platí, že když jsou buňky infikovány TcdB, ztrácejí nejen svou strukturální integritu, ale také snížení F-aktinových vláken. Zaokrouhlování buněk pomocí TcdB trvá nejdéle 2 hodiny (obr. 4), ale pokud jde o buněčnou smrt, může to trvat přibližně 24 hodin. S ohledem na Clostridium difficile-associated diarrhea (CDAD), účinky cytopathicity jsou kritičtější než skutečné buněčné smrti, protože jakmile buňky ztratí integritu cytoskeletu aktin vlákna, ale také ztratit své normální funkce.
obrázek 4: účinky toxinu B na astrocyty potkanů. Toto je pravděpodobná ilustrace astrocytů potkanů inkubovaných se 100 ng / ml toxinu B po dobu 2 hodin při 37 °C.
účinky na malé GTPasesEdit
příčinou cytotoxickou aktivitu TcdB v rámci hostitelské buňky je převážně zprostředkován receptorem endocytóza. Kyselé endozomy umožňují toxinu B vstoupit do cytosolu. K tomuto jevu dochází vazebnou receptorovou oblastí, která umožňuje toxinu vstoupit do hostitelských buněk. Díky dostupnosti cytosolu hostitelských buněk deaktivuje tcdb malé GTPázy (obr. 5), např. členové rodiny Rho Rac a Cdc42 procesem glykosylace threoninu 35 v Cdc42 a Rac a threoninu 37 v Rho. Tyto Rho GTPases se nacházejí všude v cytosolu eukaryotických buněk, které jsou zodpovědné za organizaci aktin cytoskeletu, protože toxiny v cytosolu způsobit kondenzaci aktinová filamenta v důsledku buněčné zaokrouhlování a blebbing membrány (Obr. 3), což nakonec vede k apoptóze. Tcdb způsobuje kritické změny v dynamice a morfologii buněk. Obrázek 3 ukazuje pravděpodobný účinek toxinu B na povrch buňky; membrána blebing (černé šipky). Kromě toho TcdB inaktivuje Rho GTPázy. V důsledku toho dochází k narušení spojení buněk a buněk, což zvyšuje epiteliální permeabilitu toxinu B a akumulaci tekutin v lumenu. Jedná se o jeden z hlavních příčinných činitelů při uzavírání průjmu spojeného s Clostridium difficile (CDAD)(obr. 5).
obrázek 5: intracelulární modifikace TcdB. Za prvé, Toxin B se váže na povrch buňky a je internalizován endocytózou zprostředkovanou receptorem. Za druhé, okyselení endosomu vyvolává tvorbu pórů, kterými je GTD translokováno. Zatřetí, vychytávání UDP-glukózou pomáhá vázat se na GTPázy a uvolňovat se do cytosolu. Nakonec GTD glukosyluje Rho rodinu Gtpáz na buněčné membráně a řídí transkripční regulaci a nakonec apoptózu buňky.
kromě toho je rychlost hydrolýzy UDP-glukózy TcdB přibližně pětkrát vyšší než TcdA. Několik studií ukázalo, že Rho vykazuje posttranslační modifikaci prenylací a karboxymethylací, ke které dochází na cytoplazmatické straně plazmatické membrány, tedy výměnou GTP na GDP. Když se tcdb váže na Rho a jiné malé GTPázy, GTP hydrolyzuje na HDP, což vede k GTP vázané (aktivní) na HDP vázané (neaktivní) (obr. 5). Kromě toho je tato výměnná aktivita regulována guaninovými faktory v cytosolu buňky.
porucha signálních drahedit
buněčná regulace Rho, Rac a Cdc42 má účinky mimo okolí aktinových vláken cytoskeletu (obr. 4) jsou tyto malé GTPázy začleněny do buněčného cyklu, který reguluje signály prostřednictvím mitogenem aktivovaných proteinkinázových kináz (MAPKKs). Některé fyziologické části buněk, které nejsou zapojeny do aktinových vláken, nemusí okamžitě způsobit zaoblení buněk nebo buněčnou smrt, ale v činnosti po proudu mohou vést ke zhoršení aktinových vláken a nakonec ke smrti buněk.
v roce 1993 studie provedená Shoshan et al., ukázalo, že buňky s TcdB změnily aktivitu fosfolipázy A2. Jednalo se o nezávislou událost z narušení aktinového cytoskeletu. Shoshan et al., také ukázalo, že TcdB inhibuje signální aktivitu receptoru deaktivací proteinů Rho prostřednictvím fosfolipázy D.
Pórů formationEdit
TcdB přistupuje vnitřek buňky prostřednictvím clathrin-zprostředkovanou endocytózu, Když toxin B je součástí cytosolu, glucosyltransferase prochází endosomal membránu, která snižuje pH, indukuje translokaci a nakonec vede k morfologické změny translokace regionu rezidua (958-1130). Hydrofobní oblasti jsou vloženy do hostitelské membrány za vzniku pórů, které umožňují průchod glukosyltransferázových domén. Když jsou buňky infikovány TcdB v kyselém prostředí, tlumí toxiny a způsobuje tvar přestavby (Obr. 6). V důsledku kyselého pH vykazuje TcdB jasné rozdíly v původní fluorescenci tryptofanu, citlivosti proteáz a hydrofobních površích. Další skupina ukázala, že okyselení vede ke konformačním změnám toxinu a co je důležitější, pomáhá vytvářet póry. Domnělá translokační oblast (obr. 2) tvoří přibližně 801-1400 aminokyselin, z nichž zbytky 958-1130 jsou hydrofobní a jsou zodpovědné za tvorbu transmembránových pórů. Většina studií používá TcdB kmen 630 ukázat pórů tvorba aktivita C. difficile toxinů.
Vyvolané pHEdit
zjistit, zda účinky proteolytických štěpení TcdB se odehrává na povrchu buňky nebo v kyselých endosomes, studie používá Bafilomycin A1, který je známo, že blokování v-typ H+-ATPases z endosomes. To snižuje kyselost endozomů. Fyziologická vychytávací dráha TcdB zabraňuje cytopatické aktivitě tcdb. Když byly buňky v kyselých podmínkách (pH 4,0) po dobu 5 minut po vazbě TcdB na povrch buňky při 37 stupních Celsia, byly pozorovány přeskupení tvaru a zaokrouhlení. Nicméně, když byly zaoblené buňky inkubovány po dobu další hodiny v neutrálním pH (7,0) s podobnými parametry, nebylo pozorováno žádné zaokrouhlení buněk. Obě studie ukázaly, že toxin B má vlastnost proteolytického štěpení, což je rozhodující pro přístup k cytosolu. Mít kyselé pH endozomu vede k topologickým změnám TcdB (obrázek 6).
obrázek 6: organizační doména TcdB.Ukazuje rozdíl mezi neutrálním a kyselým pH (4).
GeneticsEdit
gen, který kóduje TcdB bílkovin, tcdB, se nachází v chromozomální oblasti 19.6 kb. Toto je známé jako místo patogenity nebo PaLoc (Obrázek 2). Otevřený čtecí rámec (ORF) pro tcdB má délku 7 098 nukleotidů. Je důležité zmínit, že-kromě hlavních toxinových genů v oblasti PaLoc – existují tři další doplňkové geny, které kódují v oblasti PaLoc: tcdr (L), tcdC (R) a tcde uprostřed. Tyto geny pomáhají regulovat expresi TcdA a tcdb. Pomáhají také vylučovat nebo uvolňovat toxiny z buňky. Kódování genu tcdE, který se nachází mezi tcdB a tcdA, je analogický holin proteiny, tak, to je navrhl, že tcdE funguje jako zprostředkovatel gen, který zvyšuje uvolňování nebo vylučování TcdA a TcdB v důsledku toho se zvyšuje propustnost membrány hostitelské buňky.
Obrázek 2: Archetypální Patogenity Locus (PaLoc),kódování velké toxinů klostridií(LCTs) podílí se na C. difficile infekce CDI.
detekce Toxinuedit
existují různé velikosti plazmidu C. difficile. Zjištěné molekulové hmotnosti se pohybují od 2, 7×106 do 100×106, ale velikosti plazmidů nevykazují žádnou korelaci s toxicitou. Za účelem zjištění hladiny toxinu B v C. difficile lékaři rozsáhle používají testy buněčné kultury odvozené ze vzorků stolice od pacientů s PMC. Test buněčné kultury je považován za „zlatý standard“ pro detekci toxicity v C. difficile, protože malé množství toxinu B je schopno způsobit zaokrouhlení buněk (obr. 4), je tedy hlavní výhodou klinických laboratoří provádět korelace s CDAD způsobenou TcdB. I když cytotoxická aktivita velkých toxiny klostridií (LCTs) byl nalezen v PMC pacient vzorky stolice, toxin B aktivitu, měli více škodlivé cytotoxické účinky v porovnání s toxin a. Proto, aktivita toxinu je oslabené, když to není izolován od toxinu B. detekce C. difficile, toxicita je velmi citlivý, nicméně, s použitím buněčné kultury test umožňuje klinické laboratoře překonat výzvu; použití dávek až 1 pg / mL toxinu B stačí k vyvolání zaokrouhlení buněk. To je hlavní výhoda při použití testu kultivační tkáně k detekci toxicity u pacientů s PMC. I když klinické laboratoře se pokusil použít test mikrotitrační destička enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) a další techniky pro detekci cytotoxické aktivity toxinu B ve výkalech PMC pacientů, výsledky nejsou tak přesné, jako ty, kde buněčné kultury, testy byly použity.
výrobní faktoreditovat
přidáním antimikrobiálních látek, např. klindamycin, do kultivačního růstového média, studie ukázaly, že cytotoxická aktivita v kulturách C. difficile se zvyšuje 4-8krát. Kromě toho, s vědomím role antibiotik na příčiny PMC, mnoho dřívějších studií zaměřených na účinky antimikrobiální produkce toxinů. Výsledkem bylo, že studie dokázaly dospět k závěru, že subinhibiční povaha hladin vankomycinu a penicilinu zvyšuje produkci toxinu v kulturách C. difficile. Množství produkce toxinu bylo korelováno s použitím růstového média pro organismy. Další studie ukázala, že vysoké hladiny produkce toxinu tcdb byly pozorovány v komplexních médiích, jako je mozkový a srdeční infuzní vývar. Vysoké hladiny toxinů byly produkovány s izolací vysoce virulentní. Naopak, nízké hladiny toxinů byly produkovány s izolací slabě virulentní. Ukazuje tedy, že produkce toxinů byla spoluregulována. Ačkoli mechanismus zapojení životního prostředí do modulace signálů exprimujících toxiny není pochopen, studie in vitro ukázaly, že exprese toxinu je posílena katabolitovou represí a stresem, např. Další studie ukázala, že omezení biotinu v dobře charakterizovaném médiu zvyšuje produkci tcdb 64krát a TcdA 35krát. To bylo provedeno s C. difficile a dávkami biotinu tak malé jako 0,05 nM. Několik dalších dřívější studie tvrdily, proti teorii, že produkce toxinu, má něco se vypořádat se stresem nebo catabolite represe buď toxinu TcdA nebo TcdB. Mnoho studií také uvádí, že hlavním důvodem rozdílů mezi jinými studiemi je produkce toxinu, která se nevyskytuje u všech izolátů C.difficile.