Co je Southern Blotting?

Hannah Simmons, M. Sc.Hodnotil Kate Anderton, B. Sc. (Editor)

Blotting je proces, prostřednictvím kterého DNA, RNA nebo proteiny přeneseny na membránu, aby být zobrazeny.

Kredit: Paul Cowan/.com

první z těchto metod byla Southern Blotting vyvinut v roce 1975 Edward Jižní, a je používán k detekci sekvencí DNA fragmentů. Od té doby byly vyvinuty dvě další metody, nazývané Severní a západní blotování. Jedná se o procesy, které se používají k identifikaci RNA a proteinových sekvencí.

metodika Southern blotting

fragmenty DNA jsou zpočátku generovány restrikčními enzymy a odděleny velikostí v procesu zvaném gelová elektroforéza. Alkalické se pak používá k denaturaci zdvojnásobil-pletl DNA, které tvoří jeden prameny. DNA je pak přeneseny na nitrocelulózové nebo nylonové list umístěním membrány nad gel a pomocí tok z vyrovnávací paměti na podporu pohybu DNA z gelu na membránu.

kapilární tok a vakuový přenos jsou dvě nejběžnější metody používané k přenosu fragmentů DNA. V kapilárním toku je gel umístěn nad úrovní pufru na nosném bloku s membránou umístěnou nahoře. Stoh absorpčních ručníků se pak umístí na membránu a používají se k absorpci pufru zpod gelu, zvedání fragmentů DNA na membránu.

pomocí vakuového přenosu se membrána umístí pod gel a obě se ponoří do pufru. Vakuum se pak používá k vytvoření toku, který táhne fragmenty DNA dolů na membránu.

zahřívání nebo UV záření se pak používá k zajištění toho, aby fragmenty DNA zůstaly trvale připojeny k membráně, při zachování specifického uspořádání DNA. Jednovláknové značené sondy se pak používají k vazbě na cílové sekvence.

list se inkubuje s těmito sondami a váží se pouze komplementární sondy. Nekomplementární sondy se pak z membrány promyjí, čímž se zajistí, že zůstanou pouze navázané sondy. Tyto sondy pak mohou být detekovány autoradiografií, aby se odhalil vzor hybridizace na rentgenovém filmu.

aplikace Southern blotting

Southern blotting má mnoho různých použití. Za prvé, genové přesmyky mohou být analyzovány. Například v imunologii lze tuto metodu použít k identifikaci klonálních přesmyků genů receptoru T buněk. Za druhé, specifické fragmenty DNA lze identifikovat ze směsi mnoha dalších fragmentů.

další příklady použití zahrnují polymorfismus délky restrikčních fragmentů (RFLP)a analýzu tandemového opakování s proměnným číslem (VNTR). RFLP používá rozdíly v délce v homologních sekvencích DNA k mapování genomů, a může být použit ve forenzních a otcovských testech.

VNTR analýza používá rozdíly v délce opakovaných nukleotidových sekvencí k vytvoření otisků prstů DNA, což je metoda, která se běžně používá v otcovství a forenzním testování.

tyto metody lze také použít při diagnostice onemocnění způsobeného mutací, například srpkovitou anémií. Tento genetický stav je způsoben polymorfismem jednoho nukleotidu (a až T) v genu beta-globinu, což má za následek abnormální hemoglobin.

Southern blotting pro syndromu fragilního X

Southern blot byly použity značně pomoci identifikovat geny s zesíleny opakovat regionů. Jedná se o krátké, opakující se sekvence v DNA, které nekódují genové produkty. Jedním z příkladů, kdy může být Jižní blotování užitečné, je diagnostika syndromu křehkého X. Tento genetický stav je způsoben zvýšením oblasti opakování CGG / CCG, která je umístěna v genu FMR1.

tento gen obvykle obsahuje mezi 5-40 opakovanými oblastmi. Jedinci s 55-200 opakováními mají PREMUTACI genu FMR1 a jedinci s >200 opakováními mají syndrom křehkého X. Zvýšení opakování vede k methylaci genu, který inhibuje transkripci a zabraňuje produkci proteinu FMRP. Tento protein je nutný pro normální funkci nervového systému, proto ztráta funkce bílkovin vede k příznakům křehkého X syndromu.

V diagnostice, metylace-citlivé omezení enzym EclX1 a Metylace-necitlivé enzymu EcoR1 jsou používány k tomu, aby diferenciace metylovaných alel a non-metylovaných alel. Methylované alely jsou řezány pouze jednou, aby se získal singulární fragment DNA 5,1 kb.

nicméně nemethylované alely jsou řezány dvakrát, čímž vzniká fragment 2,8 kb. Non-methylovaných premutation opakuje (<200) proto mohou být odlišeny od methylovaných mutace se opakuje kolem 200 opakuje dlouho, jak southern blotting může být použit k určení velikosti fragmentů DNA.

do Budoucnosti

Celkově lze říci, Southern blotting je důležitá metoda v diagnostice a studiu onemocnění (např. syndrom fragilního X a srpkovitá anémie) a analýza DNA z jiných důvodů (například forenzních a testování otcovství).

southern blotting je však velmi technicky složitý, nákladný, pracný a vyžaduje velké množství vzorku DNA. Nové metody proto pomalu nahrazují jižanské blotování, například PCR v reálném čase. Tento proces je mnohem jednodušší a rychlejší než jižní blotování a vyžaduje pouze velmi malý objem DNA.

další čtení

• Veškerý obsah genetiky
• co je genetika?
• Historie Genetiky
• Genetika a Genové Exprese
• Genetické Změny

Napsal

Hannah Simmons

Hannah je lékařské a vědy o životě spisovatele s Master of Science (M. Sc.) titul z Lancaster University ve velké BRITÁNII. Než se stal spisovatelem, Hannahův výzkum se zaměřil na objev biomarkerů pro Alzheimerovu a Parkinsonovu chorobu. Pracovala také na dalším objasnění biologických cest zapojených do těchto nemocí. Mimo svou práci, Hannah ráda plave, vezme svého psa na procházku a cestuje po světě.

Citace