Genetické kříže

genetický kříž je účelné páření dvou jedinců, které má za následek kombinaci genetického materiálu u potomků. Kříže může být provedena v mnoha modelových systémů—včetně rostlin, kvasinek, mouchy a myši—a mohou být použity k pitvat genetické procesy nebo vytvářet organismy s novými vlastnostmi.

Toto video se bude týkat některé z principů genetických kříže, zkoumat jednu metodu pro provedení kříže známý jako tetrádová analýza, a diskutovat o několik aplikací této techniky.

nejprve si představme základní principy dědičnosti, které umožňují genetické kříže.

fenotyp organismu nebo složení znaků je ovlivněno jeho genetickým složením nebo genotypem. Ve většině pohlavně se rozmnožující organismy, rodičovská generace produkuje haploidní gametou buněk, které mají jednu kopii každém jednotlivém chromozomu. Ty se pak během páření spojí a vytvoří diploidní potomstvo se dvěma homologními kopiemi každého chromozomu. Pokud oba chromozomy obsahují stejnou alelu, nebo variantní forma genu, pak je organismus v tomto genetickém lokusu“ homozygotní“; jinak, je to „heterozygotní“.“

aby se cyklus začal znovu, diploidní organismus znovu generuje haploidní gamety prostřednictvím meiózy. Během tohoto procesu procházejí dva homologní chromozomy „rekombinací“, kde se mezi párem vyměňují bity ekvivalentních sekvencí. Tento proces zamíchá rodičovské alely zděděné každým potomkem, čímž se zvyšuje jejich genetická rozmanitost.

jedním z prvních lidí, kteří prováděli systematické genetické kříže, byl“ otec genetiky “ Gregor Mendel. Pomocí snadno manipulovat rostlina hrachu, a zkoumá řadu rysů s konzistentní vzory dědičnosti, Mendelovy byl schopen odvodit tři základní zákony dědičnosti, které budou základem genetiky.

Mendelův první zákon je zákon Uniformity, který uvádí, že heterozygotní potomci první nebo F1 generace dvou homozygotních jedinců budou mít fenotyp pouze jednoho rodiče. Alela zakládající tento fenotyp se nazývá „dominantní“, zatímco „skrytá“ alela je „recesivní“.“Nyní víme, že vztahy dominance jsou často méně jasné, s případy, jako je neúplná dominance, kde heterozygoti vyjadřují smíšený fenotyp; a kodominance, kde jsou zobrazeny oba fenotypy.

zákon segregace uvádí, že ke každé gametě je náhodně přiřazena jedna alela. Pozorováním, že potomci F2 ze samooplodnění heterozygotních jedinců F1 vykazovali a 3:1 fenotypový poměr, ale že dva z fenotypicky dominantních jedinců jsou ve skutečnosti heterozygoti, Mendel odvodil, že obě rodičovské alely musí být zděděny odděleně. Dnes víme, že k segregaci dochází během meiózy, kdy jsou dva homologní chromozomy diploidního rodiče náhodně rozděleny do haploidních dceřiných buněk, z nichž každá zdědí jednu ze dvou alel.

Mendelův třetí zákon je zákon nezávislého sortimentu, který uvádí, že jednotlivé rysy jsou zděděny nezávisle. Nyní víme, že absolutní nezávislost existuje pouze pro znaky řízené geny na samostatných chromozomů v haploidní sadě, které jsou distribuovány samostatně do dceřiných buněk během meiózy. Pro dva geny na stejném chromozomu, vzdálenost mezi nimi je nepřímo úměrná pravděpodobnosti, že jsou rekombinované na různých homologních chromozomů, a tím pádem, jak je pravděpodobné, že se dědí společně ve stejné potomky. Analýza čtyř meiotických produktů diploidního organismu proto poskytuje vědcům způsob, jak zmapovat umístění genů.

po přezkoumání principů genetických křížů se podívejme na protokol pro tetradovou analýzu.

Tato technika je obvykle aplikován na určité jediné buňky řas nebo plísní, jako jsou kvasinky, pitvat čtyři haploidní meiotické produkty, nebo spóry, které u těchto druhů zůstávají spolu jako „tetrad“ v rámci jedné buňky těla.

pro provedení tetradové analýzy v kvasinkách se požadované kmeny nejprve pěstují na vhodném médiu. Kvasinkové buňky z jednotlivých kolonií se mohou pářit, například pruhováním každého kmene v křížovém vzoru na nové desce. Tato deska se pak replikuje na selektivní médium, aby se izoloval pouze diploidní produkt kříže.

Vybrané diploidní buňky jsou pěstovány na živinami chudých média k navození sporulace a tetrádová formace. Asci, což jsou struktury, které drží tetrady spór, jsou tráveny v roztocích obsahujících enzym zymolyázu. Po trávení jsou jednotlivé asci manipulovány pomocí tetrad-disekčního mikroskopu. Jsou uspořádány na konkrétních místech na růstové desce a narušeny, aby se uvolnily jednotlivé spory. Tyto mohou být umístěny do mřížky-jako vzor, kde každý spor by generovat jednotlivé kolonie, které mohou být dále analyzovány.

Nyní, když víte, jak tetrádová analýza se provádí, podívejme se na některé z mnoha aplikací nebo modifikací této techniky.

Ruční pitva tetrad je časově náročné, a vědci vymysleli vysokou propustností alternativy, jako je čárový kód-umožnil sekvenování tetrad. V této metodě bylo diploidní potomstvo kvasinkového kříže transformováno knihovnou plazmidů, z nichž každá obsahuje krátkou, jedinečnou sekvenci známou jako „čárový kód“, která funguje jako identifikátor pro každé potomstvo. Plazmidy také exprimují GFP, což umožňuje výběr kvasinek asci pomocí průtokové cytometrie a třídění na agarové desky. Asci byly na talířích hromadně lyzovány a spory mohly růst do malých kolonií. Kolonie byly poté náhodně rozděleny na 96 jamkové desky pro genotypizaci. Unikátní sekvenční čárový kód umožňuje vědcům seskupit čtyři kolonie, které vznikly ze spór z každého tetradu.

genetické kříže mohou být také použity ke generování kvasinkových buněk s velkým počtem genových delecí. V procesu zeleného monstra, haploidní mutantní kvasinky nesoucí různé genové delece označené GFP jsou pářeny a sporulovány. Tyto haploidní potomstvo, z nichž některé nesou delecí zdědil od obou rodičů, jsou řazeny pomocí fluorescence-activated průtoková cytometrie, kde intenzita GFP bylo prokázáno, že korelují s počtem delece přítomen v konkrétní kmen kvasinek. Tyto vybrané buňky byly poté kultivovány a znovu zkříženy. Opakováním tohoto cyklu vznikly kmeny kvasinek obsahující četné delece.

konečně byly genetické kříže upraveny pro použití v mnoha modelových systémech, jako je intracelulární parazit Plasmodium způsobující malárii. Protože se parazit může množit pouze v jiných buňkách, musí být všechny kroky křížení provedeny u myší nebo komárů, přirozeného hostitele parazita a vektoru. Zde byly myši infikovány dvěma jedinečnými kmeny plasmodia ve fázi krevních parazitů. Paraziti pak byly převedeny do komárů prostřednictvím krve krmení, a jakmile jste uvnitř jsou splatné do gamet, že by hnojit tvoří diploidní zygoty. Zralé sporozoitů pak byly sklizeny z komára a používá infikovat naivní myši, kde paraziti jsou šířeny pro izolaci kříže potomky zájem.

právě jste sledovali video JoVE o genetických křížích. V tomto videu jsme představili principy dědičnosti, jak lze genetické kříže v některých organismech analyzovat tetradovou disekcí a několik současných aplikací. Jako vždy, díky za sledování!