Hranic, v Mikrobiologii

Úvod

Astroviridae rodina obsahuje neobalené, pozitivní smysl, single-stranded RNA viry do dvou rodů, Mamastrovirus a Avastrovirus, které infikují savce a ptáky, resp. V současné době, Mezinárodní Výbor pro Taxonomii Virů (Mezinárodní Výbor pro Taxonomii Virů , 2018) uznává, 19 druhů, a to Mamastrovirus-1 až -19, ve Mamastrovirus rodu; nicméně, tam jsou četné kmeny čeká klasifikace, z nichž některé jsou předběžně považovat za nový druh (Donato a Vijaykrishna, 2017).

od roku 2010 je několik astrovirů stále více uznáváno jako neuroinvazivní u různých druhů savců, včetně lidí (Quan et al ., 2010; Naccache a kol., 2015), norek (Blomström et al., 2010), dobytek (Li et al., 2013), Ovce (Pfaff et al., 2017) a prasata (Boros et al., 2017). Po počátečním rozpoznání bovinní encefalitidy spojené s astrovirem u skotu Spojených států (Li et al ., 2013), retrospektivní studie případů sporadické skotu encefalitidy neurčené etiologie ze Švýcarska ukázal, že to neuroinvasive astrovirus šel nepozorovaně po celá desetiletí (Selimovic-Hamza et al., 2016). I když epidemiologie a přenos tras z těchto astroviruses jsou neznámé, cross-druh přenosu bylo navrženo na základě vysoké úrovni identity (>98%), sdílené mezi skotu a ovcí neuroinvasive astroviruses na nukleotidové a aminokyselinové úrovni (Boujon et al., 2017).

bovinní astroviry (BoAstVs), pojmenované BoAstV-NeuroS1 (Li et al., 2013) a BoAstV-CH13 (Bouzalas et al., 2014), byly původně nalezeny v mozku skotu s nehnisavou encefalitidou ve Spojených státech a Švýcarsku. Přes rozdílnou nomenklaturu představují oba viry stejný genotypový druh (Bouzalas et al., 2016; Selimovic-Hamza a kol., 2017a), která stále čeká na oficiální klasifikaci ICTV. V roce 2015 byl v mozku krav s encefalitidou ve Švýcarsku identifikován dříve neznámý kmen BoAstV, pojmenovaný BoAstV-CH15. Kompletní genom fylogenetické srovnání odhalilo bližší vztah BoAstV-CH15 s ovcí astrovirus (OvAstV) než s BoAstV-CH13 (Seuberlich et al., 2016). Koinfekce s BoAstV-CH13 a BoAstV-CH15 byla také dokumentována v jednom případě (Seuberlich et al., 2016). Ve stejném roce v Německu, Schlottau et al. (2016) uvádí, román astrovirus, a to BoAstV-BH89/14, v krávě, encefalitida, která byla nejvíce úzce souvisí s OvAstV a BoAstV-CH15. Následně byl v roce 2017 identifikován BoAstV-CH13/NeuroS1 v případech bovinní encefalitidy ve východní a západní Kanadě (Spinato et al ., 2017; Selimovic-Hamza a kol., 2017b). V roce 2018, román neuroinvasive BoAstV úzce souvisí s Severní Ameriky a Evropské BoAstV-NeuroS1/BoAstV-CH13, byl označen za vola s non-hnisavé encefalomyelitida v Japonsku a vzniku intra-genotypové rekombinace mezi Severní Ameriky a Evropské kmeny bylo navrhl, (Hirashima et al., 2018).

Zatímco případy astrovirus-spojené encefalitidy bylo hlášeno v Severní Americe, Evropě a Asii, jejich přítomnost nebyla nikdy zdokumentována na Jižní polokouli. Zde popisujeme případ astrovirus-spojené encefalitidy v dobytek v Uruguayi, která rozšiřuje geografické rozložení a genetické rozmanitosti neuroinvasive astroviruses a poskytnout phylogeographic důkazy, které naznačují, že tento virus byl představen do Ameriky z Evropy a později se rozšířil do Asie.

Materiály a Metody

Historie a Signalment

V červnu 2018, 22-month-old Holstein řídit ve skupině 37 voli v ∼300 ha zemědělské v Colonia, Uruguay, vyvinutý progresivní neurologické zpívá, včetně neobvyklé chování, bezcílné chození, kroužení, ataxie, opakující se a nekoordinované pohyby jazyka a poloze. Stádo se paslo na roční ovsené pastvině a bylo doplněno kukuřičnou siláží. Předpokládaná klinická diagnóza mozkové listeriózy veterinárním lékařem vedla k léčbě penicilinem a streptomycinem, zvíře však spontánně zemřelo po klinickém průběhu trvajícím 3 dny.

Patologické Vyšetření, in situ Hybridizace (ISH) a Imunohistochemie (IHC)

vedoucí řídit byl vyjmut z jatečně upraveného těla a předložen INIA je Veterinární Diagnostické Laboratoři (Zdraví Zvířat Platforma) pro diagnostické práce-up. Polovinu mozku, krátký úsek proximální krční míchy (C1), trigeminální ganglia a kořene trojklanného nervu, slinné žlázy, retrofaryngeální lymfatických uzlin, hltanu, jícnu, jazyka a kosterního svalstva, byli ponoření-opraveno v 10% neutrálním pufrovaném formalínu po dobu 48-72 h. Tkáně byly pravidelně zpracovávány pro histologie, vložené do parafínu, mikrotom-dělené na 4-5 µm a obarveny hematoxylinem a eosinem (H&E) a Gram skvrn.

Chromogenní ISH byla provedena ručně na 5 µm části formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) mozkového kmene, mozečku a mozku na Superfrost Plus skluzavky (Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, Spojené Státy) pomocí RNAscope 2.5 Red assay kit (Cat #322360, Advanced Cell Diagnostics, Hayward, CA, Spojené Státy) a BoAstV sonda Kočka. #406921. Sonda se skládá z 20 párů zaměřených na oblast 5232-6180 viru (GenBank KF233994. 1). Každá 5 µm část tkáně byla před hybridizací sondy předběžně ošetřena teplem a proteázou po dobu 2 hodin při 40°C a zpracována podle doporučení výrobců. Negativní kontroly používané pro validaci signálu zahrnuty nesouvisející (GC-obsah uzavřeno) sonda běh na sériové řezy a sondování tkáně z neinfikovaných zvířat. Diapozitivy byly kontrastovány s hematoxylinem a namontovány s EcoMount (Biocare Medical, Concord, CA, Spojené státy americké).

kromě toho byl IHC proveden v sekcích FFPE mozkového kmene, mozku a mozečku, jak bylo dříve popsáno, pro identifikaci viru Západonilského (WNV, Flavivirus) (Palmieri et al ., 2011), virus vztekliny (Lyssavirus) (Stein et al., 2010) a Chlamydia spp. (Giannitti et al., 2016) antigeny.

Molekulární Virologie

Nukleové kyseliny, extrakce byla provedena ze směsného vzorku zmrazené (-20°C) mozku pomocí MagMAX Nukleové Kyseliny Izolace Kit® (Thermo Fisher Scientific). Pro astrovirus detekce, reverzní transkripce (RT) byla provedena s RevertAid Reverzní Transkriptázy® (Thermo Fisher Scientific) a random hexamer primerů (Qiagen). PCR byla provedena z cDNA pomocí MangoMix® (Bioline) a primery, které zesilují 432-nukleotidů fragment astrovirus polymerázové gen (Tse et al., 2011). Produkt PCR byl vizualizován ve 2% agarózovém gelu, čištěn pomocí Purelink® Quick gel Extraction and PCR Purification Combo Kit (Invitrogen) a sekvenován v Macrogen Inc. (Soul, Jižní Korea). Pro astrovirus celého genomu amplifikace, Maxima H Minus Reverzní Transkriptázy (Thermo Fisher Scientific) a oligo(dT)18 pro pořízení z cDNA, a MangoMix® (Bioline) nebo Ranger DNA Polymerase (Bioline) s primery popsané Hirashima et al., 2018, byly použity. Produkty PCR byly vizualizovány v 1-2% agarózovém gelu, čištěny a sekvenovány, jak je uvedeno výše. Sestava sekvence byla provedena se Seqmanem (Lasergene 8, DNASTAR). Dvacet-šest kompletních genomových sekvencí neuroinvasive astrovirus ze skotu, ovcí, prasat, člověka a norek, a střevní skotu astrovirus k dispozici v GenBank byly staženy a zarovnány pomocí Clustal W v MEGA 7 software (Kumar et al., 2016). W-IQ-TREE1 (Trifinopoulos et al., 2016) byl použit k určení nejlepší-fit model posloupnost evoluce (SYM+I+G4) a vytvořit maximální-pravděpodobnost, že fylogenetický strom s téměř kompletní sekvence BoAstV zjištěny v tomto případě, a těch kompletních sekvencí stažených z GenBank pomocí bootstrap jako statistická metoda k posouzení clades robustnost. Podobnost plot byl proveden s SimPlot software (lol et al ., 1999). P-vzdálenosti na úrovni aminokyselin ORF2 byly odhadnuty pomocí softwaru MEGA 7 (Kumar et al ., 2016).

navíc byla provedena Bayesovská fylogeografická analýza s balíčkem BEAST v1.8.4 (Drummond et al., 2012), použití: kompletní kódování regionu BoAstV CH13/NeuroS1 linie, ORF1ab (non-strukturální geny), ORF2 (strukturní geny), ORF1a (proteázy) a částečné ORF1b (polymerázová genomické oblasti, pro které Kanadské kmeny byly k dispozici), všechny sekvence jsou k dispozici v GenBank (poslední přistoupení 18. dubna 2019), k určení evoluční rychlosti, věk/roky společné předky, a nejpravděpodobnější trasa virové oběhu země (Švýcarsko, Uruguay, usa, Kanada a Japonsko). Nedostatek rekombinace v datovém souboru byl stanoven pomocí Rekombinačního detekčního programu 4. Substituční model, který nejlépe vyhovuje každému zarovnání, byl stanoven pomocí softwaru MEGA 7 pomocí hodnot Bayesovského informačního kritéria (BIC) a časová struktura každé datové sady byla vyhodnocena pomocí TempEst (Rambaut et al ., 2016). X uvolněný molekulární hodiny s Bayesian Skyline analýzu byl vybrán Bayes Faktor mezi různými kombinacemi molekulární hodiny a splývající strom záznam použit. Země detekce byla použita jako rys. Na Markov chain Monte Carlo délka byla 100 milionů generací, zajištění konvergence analýzy vyhodnoceny v Tracer v1.6.0 a zadní pravděpodobnost byla použita k vyhodnocení clades. Maximální clade důvěryhodnost strom (MCCT) byla získána pomocí TreeAnnotator software od zvířete a zobrazil v FigTree v1.4.3.

nakonec byla DNA extrahovaná ze zmrazeného mozku zpracována pomocí PCR pro detekci bovinních herpesvirů 1 a 5 (BHV-1 a -5), jak bylo dříve popsáno (Ashbaugh et al., 1997).

Bakteriologie

Čerstvé vzorky mozku a mozkového kmene byly pravidelně zpracovávány pro aerobní bakteriální kultury v krvi a MacConkey lze testovat kolonie, a selektivní kultury pro Listeria monocytogenes (Al-Zoreky a Sandine, 1990).

Výsledky a Diskuse

klinických příznaků a epidemiologických zjištění v případě zde popsaných, byť non-specifické, byly podobné těm, které jsou popsány v jiných případech skotu astrovirus-spojené encefalitidy, který je obvykle popisován jako sporadické (Selimovic-Hamza et al., 2016), s různými neurologickými deficity (Deiss et al., 2017), s trváním klinických příznaků, které se obvykle pohybují od 1 dne do 3 týdnů (Schlottau et al ., 2016; Deiss et al., 2017; Spinato a kol., 2017; Hirashima a kol., 2018).

makroskopické vyšetření mozku, segmentu C1 míchy a dalších tkání hlavy neodhalilo významné hrubé anatomické léze. Histologicky, tam byl středně těžké až těžké, lymfocytární, histiocytární a plasmacytic meningoencephalomyelitis ovlivňující telencephala (včetně mozkové hemisféry a hippokampus), mozkový kmen, a jen zkoumal segmentu míchy. Léze byly převážně distribuovány v šedé hmotě a omezujících oblastech bílé hmoty. V postižených oblastech bylo perivaskulární přehýbání a lymfoplasmacytická a histiocytární zánět a neuronální nekrózy/neuronophagia s gliosis v přilehlé neuropil. Došlo k satelitóze postižených nekrotických neuronů (obrázky 1A-D). Léze byly mnohem méně časté a závažné v mozkovém parenchymu, i když došlo k multifokální středně cerebelární leptomeningitidě. Nebyly nalezeny žádné intralezionální bakterie S H&e a gramovými skvrnami. V ostatních vyšetřovaných tkáních nebyly zjištěny žádné významné histologické změny.

při histologickém vyšetření centrálního nervového systému bylo podezření na neuroinvazivní virovou infekci. Skot s encefalitidou je znepokojen, protože mnoho neuropatogenů přežvýkavců je zoonotických (Cantile a Youssef, 2016) ; diagnóza encefalitidy by tedy měla vést k rozsáhlému laboratornímu testování, aby bylo možné vyšetřit infekční agens, pokud je to možné. V případě zde popsaném, IHC pro WNV, virus vztekliny a Chlamydia spp. a PCR pro BHV-1 a -5 byly všechny negativní a z mozkové tkáně nebyly kultivovány žádné patogenní bakterie. Protože řídit < 2 roky staré a ne spongiformní změny byly pozorovány v mozkovém kmeni, bylo zvíře nejsou testovány na bovinní spongiformní encefalopatie (BSE), což je exotické nákazy z dospělého skotu, který nebyl nikdy hlášen v Uruguayi. BSE navíc není zánětlivá (Cantile a Youssef, 2016).

In situ hybridizace byla provedena pomocí sondy generovány z BoAstV-NeuroS1, a tam byl sondy hybridizace bohaté uvnitř, a omezena na cytoplazmy neuronů v mozkové hemisféry a hippokampus (Obr. 1E–G). V těchto oblastech se hybridizace sondy kolokalizovala s nekrotickými neurony a oblastmi gliózy, bez hybridizace sondy detekovatelné v gliových buňkách nebo zánětlivých buňkách perivaskulárních manžet. Žádné virové nukleové kyseliny byl detekován ISH v mozečku, který měl jen minimální zánětlivé léze v parenchymu ale mírné leptomeningitis, nebo mozkového kmene, včetně úseků s těžkým zánětem. To znamená, že, topograficky, detekce virových distribuce ISH byl omezen více, než encefalitida v sekcích zkoumal, které se příležitostně byly popsány v případech BoAstV-CH13/NeuroS1-spojené encefalitidy u skotu (Selimovic-Hamza et al., 2017a, b). Důvod pro tento občasný nedostatek virové RNA detekce v lesioned oblastech mozku může být detekční limit ISH, nebo clearance viru v zanícené oblasti mozku, o době smrti, jak již dříve navrhl (Selimovic-Hamza et al., 2017b). Jak se očekávalo, žádná hybridizace sondy nebyla detekována ISH v mozkové tkáni použité jako negativní kontrola.

Astrovirus byl detekován v mozku RT-PCR. Téměř kompletní sekvence genomu, analýza odhalila Mamastrovirus napětí v CH13/NeuroS1 clade, pojmenovali jsme BoAstV-Neuro-Uy, sekvence byla uložena v GenBank pod přistoupení číslo MK386569. Na fylogenetická analýza ukázala, blízkost s jinými neuroinvasive astroviruses ve Virginii/Human-Norek-Ovcí (VA/HMO) clade (Obrázek 2), který obsahuje nejznámější neuroinvasive astroviruses (Hirashima et al., 2018; Reuter a kol., 2018). Téměř úplná sekvence BoAstV-Neuro-Uy je 6427 bp na délku a má sekvenční identitu 94% s kmenem KagoshimaSR28-462. BoAstV-Neuro-Uy má podobné vlastnosti jako jiné kmeny rodu CH13/NeuroS1: 5’UTR oblasti 51 nt, ORF1a (proteázy) 861 aminokyselin (aa), ORF1b 523 aa (RNA-dependentní RNA polymeráza), a ORF2 758 aa (kapsidový protein). Bohužel, 3 ‚ UTR nemohl být sekvenován, ale předpokládá se, že je přítomen poly(a) ocas, protože oligo (dT)18 byl použit k získání cDNA. Kromě toho je přítomna heptamerická sekvence AAAAAAC, ribozomální signál posuvu snímků. P-vzdálenosti na úrovni aminokyselin ORF2 potvrdily přiřazení tohoto kmene k clade CH13/NeuroS1. P-vzdálenosti < 0.35 mezi BoAstV-Neuro-Uy a další členové tohoto kmene (Tabulka 1) podpora klasifikace tyto virové kmeny v rámci jednoho stejného druhu; Mamastrovirus-13 byl nedávno navržených jinými autory (Donato a Vijaykrishna, 2017; Hirashima et al., 2018), ačkoli definitivní přiřazení druhů ICTV čeká. Sonda použitá pro ISH, generovaná z BoAstV-NeuroS1, měla 92,7% sekvenční identitu s BoAstV-Neuro-Uy.

Studie založené na neuropatologické vyšetření a astrovirus nukleové kyseliny a bílkoviny zjištění k závěru, že existuje pravděpodobná příčinná souvislost mezi astrovirus infekce a neurologické onemocnění a lézí u skotu (Selimovic-Hamza et al., 2017a; Reuter a kol., 2018). Podle našich nejlepších znalostí nebyla encefalitida spojená s astrovirem experimentálně reprodukována. To by vyžadovalo izolaci neuroinvazivních astrovirů od klinických případů, což se v našem případě nepokusilo.

zdroj Chloubyv-Neuro-Uy v tomto případě nebylo možné určit. Je však třeba vzít v úvahu dobytek a volně žijící zvířata, protože skot byl chován za rozsáhlých venkovních podmínek. Postižené zvíře bylo zakoupeno a přesunuto na farmu v únoru 2018 spolu s dalšími 9 voly. Majitel bohužel odmítl další odběry a testování dalších zvířat v objektu a podrobnější epidemiologické šetření. U žádného z ostatních zvířat ve skupině nedošlo k neurologickému onemocnění od srpna 2018, Naposledy byl kontaktován Veterinární lékař. Sezónnost od začátku zimy do konce jara bylo navrženo pro případy astrovirus-spojené encefalitidy ve Švýcarsku (Selimovic-Hamza et al., 2016). Zajímavé je, že zde popsaný případ nastal v červnu, což odpovídá přechodnému období podzim-zima na jižní polokouli.

zatímco neurotropní astroviry byly identifikovány v Severní Americe (Li et al ., 2013; Spinato a kol., 2017), Evropa (Bouzalas et al., 2014) a Asie (Hirashima et al., 2018), jejich přítomnost nebyla nikdy zaznamenána na Jižní polokouli, takže tato komunikace rozšiřuje geografické rozložení astrovirus-spojené encefalitidy. Posoudit, zda virový kmen zjištěn v Uruguayi mají původ v Evropě, Severní Americe, nebo Asii, odhadli jsme, že evoluční rychlost a provedena analýza phylogeographic pomocí neuroinvasive BoAstV k dispozici sekvence v GenBank. Evoluční rychlost odhadovaná pomocí kompletní kódovací oblasti byla 4.27 × 10-4 (95% nejvyšší hustota pravděpodobnosti-HPD -, 2,19-6,46 × 10-4) substituce nukleotidů / místo / rok, což se očekává u RNA viru (Jenkins et al ., 2002), ale nižší, než se odhaduje u enterických lidských astrovirů (Babkin et al., 2012, 2014). Na ORF1ab regionu ukázaly podobné evoluční rychlost (4.20 × 10-4, 95% HPD 1.66–6.46 × 10-4 substituce/web/rok) jako kompletní kódování regionu, zatímco ORF1a (2.92 × 10-4, 95% HPD 1.19 × 10-6-6.46 × 10-4 substituce/web/rok) a ORF2 (2.86 × 10-4, 95% HPD 4.13 × 10-6-5.79 × 10-4 substituce/web/rok) vykazovaly mírně rychlejší evoluční rychlost, a částečné polymerázové genomické oblasti (ORF1b) vykazovaly mírně pomalejší evoluční rychlost (5.39 × 10-4, 95% HPD 6.41 × 10-7-1.10 × 10-3 substituce/web/rok).

Jak stanoví analýza phylogeographic s kompletní kódování regionu, a je znázorněno na MCTT (Obrázek 3), jsou tam dva sub-linie (CH13 a NeuroS1) na základě referenční kmeny, které mají společného předka. Poslední společný předek těchto sub-linie (lineage CH13/NeuroS1) vznikla v Evropě přibližně v roce 1885 (95% HPD, 1794-1940). Na začátku roku 1900, dva sub-linie rozešly, CH13 sub-linie zůstala v oběhu v Evropě, zatímco NeuroS1 sub-linie rozšířila do Ameriky a Asie. Nejpravděpodobnější scénář je, že NeuroS1 sub-rod byl představen v Uruguay z Evropy kolem roku 1921 (95% HPD, 1849-1967), pravděpodobně prostřednictvím hospodářských zvířat, obchodu, pak se rozšířil do Severní Ameriky a později do Japonska (viz Obrázek 3). Vzhledem k omezení v počtu sekvencí je k dispozici v GenBank, které by mohly mít neobjektivní analýzy, výsledky získané pomocí kompletní kódování regionu byly srovnávány s výsledky získanými s jinými genomových regionů (ORF1ab, ORF2, ORF1a, a ORF1b), k dispozici pro větší počet kmenů (tj. Kanadské kmeny). Ve všech analýzách je nejpravděpodobnějším scénářem, že k zavlečení viru do Uruguaye došlo z Evropy (doplňující údaje S1A-D). Kromě toho, předpokládané datum pro tento úvod, získané s ORF1ab a částečné polymerázové genomické oblasti (ORF1b) (Doplňující Údaje S1A,D), byl podobný jako získané s kompletní kódování regionu, vzhledem k tomu, že předpokládané datum zavedení získané s ORF2 a ORF1a bylo dříve, ale s širší 95% HPD intervalu (Doplňující Údaje, S1B,C). Úvod sub-linie NeuroS1 přímo do Kanady, z Evropy, s následným rozšířila do Spojených Států a Japonska, je také pravděpodobné, y zobrazeny na Doplňkovém Obrázku S1D.

Další vyšetření jsou potřebné k posouzení geografické rozložení, patogenní mechanismy (zejména mechanismy přenosu a vstupu), molekulární epidemiologie, a potenciální mezidruhový přenos neuroinvasive astroviruses.

dostupnost dat

datové sady generované pro tuto studii lze nalézt v GenBank, MK386569.

autorské příspěvky

FG, RDC a MC přispěly koncepcí studie. FG a RDC provedly patologické vyšetření a odběr vzorků. PP provedl in situ hybridizaci. FU provedl imunohistochemii. LM, RC a MC provedly testování molekulární virologie. MC provedl sekvenční a fylogeografické analýzy a související obrázky. FG a PP získaly histologické obrazy. MF provedl bakteriální kultury. FG a MC napsali první návrh rukopisu. RDC, PP, FU, LM, MF, a RC napsal části rukopisu. Všichni autoři přispěli k revizi rukopisu, přečetli a schválili předloženou verzi.

finanční Prostředky

Tato práce byla financována Granty PL-015 N-15156 od INIA a 158 z „Programa de Iniciación a la Investigación 2017 „z“ Comisión Odvětvové de Investigación Científica “ (CSIC). MC a RDC potvrzují podporu „národní agentury pro výzkum a inovace“ (ANII) a INIA prostřednictvím Ph.D. stipendií. FG uznává podporu od ANII prostřednictvím mobility grant MOV_CA_2018_1_150021.

Prohlášení o střetu zájmů

autoři prohlašují, že výzkum byl proveden bez jakýchkoli obchodních nebo finančních vztahů, které by mohly být vykládány jako potenciální střet zájmů.

recenzent TS deklaroval minulé spoluautorství s jedním z autorů PP redakci manipulace.

Poděkování

autoři děkuji Yisell Perdomo a Cecilia Monesiglio od INIA, a Karen Sverlow a Juliann Beingesser z CAHFS pro technickou pomoc.

Doplňkový Materiál

Doplňkový Materiál pro tento článek lze nalézt online na: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2019.01240/full#supplementary-material

OBRÁZEK S1 | Maximální clade důvěryhodnost stromy (MCCTs) získané analýzou full-délka ORF1ab (A), full-délka ORF2 (B), full-délka ORF1a (C), a částečné ORF1b (D). Barva pobočkami představuje největší pravděpodobností zemi, kde předkové oběhu, zadní pravděpodobnost hodnoty jsou uvedeny ve větvích, a čísla v každém uzlu představují letech původu pro každé clade s 95% HPD intervalu. Podlinky jsou označeny štítky.

Poznámky pod čarou

1. ^http://iqtree.cibiv.univie.ac.at