Kreativní Proteomika Blog

sekvence aminokyselin v proteinu nebo peptidu mohou být identifikovány Edman rozkladu, který byl vyvinut Pehr Edman. Tato metoda může označovat a štěpit peptid z n-terminálu bez narušení peptidových vazeb mezi jinými aminokyselinovými zbytky. Edmanova degradační reakce byla automatizována v roce 1967 Edmanem a Beggsem. V dnešní době se široce používá automatizovaná degradace Edmana (proteinový sekvenátor) a může sekvenovat peptidy až do 50 aminokyselin.

Cyklické degradace peptidů na základě reakce phenylisothiocyanate s volnou aminoskupinou na N-terminální zbytky taková, že aminokyseliny jsou odstraněny jeden po druhém, a identifikován jako jejich phenylthiohydantoin deriváty. Mluvení na konkrétní proces, nenabité peptid se nechá reagovat s phenylisothiocyanate (PITC) na amino konci za mírně alkalických podmínek dát phenylthiocarbamoyl derivát (PTC-peptid). Poté za kyselých podmínek thiokarbonylová síra derivátu napadá karbonylový uhlík n-koncové aminokyseliny. První aminokyselina se štěpí jako derivát anilinothiazolinonu (ATZ-aminokyselina) a zbytek peptidu může být izolován a podroben dalšímu degradačnímu cyklu. Po vytvoření je tento derivát thiazolonu stabilnější než derivát fenylthiokarbamylu. Aminokyselina ATZ se pak odstraní extrakcí ethyl acerátem a převede se na derivát fenylthiohydantoinu (PTH-aminokyselina). A chromatografie může být použita k identifikaci zbytků PTH generovaných každým cyklem.

Jak na automatické Edman degradace, proteiny mohou být analyzovány za použití v-řešení na TFA filtr a pak naloženy na Edman sekvenování nástroje. Proteiny ve směsích jsou nejprve odděleny 1D nebo 2D gely a poté blotovány na PVDF membránu. Proteiny jsou detekovány pomocí Coomassie blue, Amido black nebo Poncau S barvením a proteiny zájem vystřihnout a PVDF membrána kus naloženo na Edman sekvencer.

S hmotnostní spektrometrií bylo vyvinuto použití edmanova degradačního sekvenování. Zůstává však metodami pro několik typů aplikací proteinové strukturní analýzy. To může být použit pro ověření N-koncové hranice rekombinantních proteinů nebo určení N-konci proteáza-rezistentní domény, zvláště když je protein, nebo domény je >40-80 kDa nebo nemohou být snadno očistit. Může být také použit k identifikaci nového n-terminálního a proteolytického štěpného místa v proteinových fragmentech. Kromě toho, jak se některé nové proteiny a peptidy, kde sekvence databáze nejsou k dispozici pro MS/MS vyhledávání v databázi, Edman degradace může být použit pro analýzu.

n-koncová aminokyselina proteinu může být odštěpena. V tomto procesu tedy první cyklus identifikuje přesnou n-koncovou aminokyselinu. Kromě toho, protože uvolněné aminokyseliny jsou identifikovány a kvantifikovány chromatografií, lze identifikovat aminokyseliny s identickou molekulovou hmotností. Například isoleucin a leucin mají Hmotnost 113 Da, ale mají různou retenční dobu. Edmanovo sekvenování lze navíc provádět na PVDF blotech z 1D a 2D gelů, což umožňuje N-terminální sekvenování proteinů ve směsi. Sekvenování edmanovy degradace však nebude k dispozici, pokud byl peptid, jehož N-konec byl chemicky modifikován, jako je acetylace. A protože PITC nemůže reagovat s ne-α-aminokyselinou, sekvenování se zastaví, pokud se vyskytne ne-α-aminokyselina jako kyselina isoasparagová. Větší proteiny navíc nemohou být sekvenovány Edmanovým sekvenováním.

Na Kreativní Proteomika, náš profesionální protein sequencing platforma poskytuje N-terminální sekvence analýzy Edman degradace nebo hmotnostní spektrometrie (MS), doplňkové výhody k sobě navzájem. Náš tým odborníků s rozsáhlými zkušenostmi vám pomůže pochopit, co se snažíte prozkoumat a splnit vaše požadavky. Kromě toho můžeme poskytnout další služby identifikace bílkovin, včetně:

• Peptide mass fingerprinting (PMF) služby
• Sekvenční analýza peptidů nebo proteinů
• De novo protein sequence analysis service
• Brokovnice bílkovin identifikace služby
• Membrána proteomika služby