Tyrosinase
8.14.2.2.4 Tyrosinase (EC 1.14.18.1) a katechol-oxidáza (EC 1.10.3.1)
Tyrosinase, který patří do proteinové rodiny, které mají katalytické centrum tvořené dvěma typ-3 mědi, katalyzuje orthohydroxylation z monophenol a následné oxidaci diphenolic produktu, aby výsledný chinon.178 za současné redukce molekulárního kyslíku na vodu dochází k řadě reakcí. Chinonový produkt je reaktivní prekurzor pro syntézu melaninových pigmentů. Tyrosinázu, který je obsažen v zelenině, ovoce a houby, je klíčový enzym v browning, který se vyskytuje na modřiny nebo dlouhodobé skladování. U savců je enzym zodpovědný za abnormality pigmentace kůže, jako jsou skvrny a defekty.179 tyrosináza je tedy poměrně významná v oblastech zemědělství a průmyslu. V kosmetickém průmyslu je zvláště atraktivní vývoj a screening silných inhibitorů tyrosinázy.
tyrosináza je zařazena do skupiny měděných proteinů typu 3, stejně jako katecholoxidáza a respirační pigment hemocyanin. Během katalytické reakce existuje měděné centrum tyrosinázy typu 3 ve třech redoxních formách.178 deoxy forma (Cu (I– – Cu (I)) je redukovaný druh, který váže kyslík za vzniku kyslíkové formy (Cu (II) – O22–Cu(II)). V kyslíkové formě je molekulární kyslík vázán jako peroxid v režimu μ-η2:η2 side-on přemostění, který destabilizuje O-O vazbu a aktivuje ji. Forma met (Cu (II– – Cu (II)) se předpokládá jako klidová enzymatická Forma, kde ionty Cu (II) jsou normálně přemostěny na malý ligand, jako je molekula vody nebo hydroxidový iont.
Katecholoxidáza oxiduje ortodifenoly na odpovídající chinony, ale postrádá monooxygenázu nebo kresolázovou aktivitu. Hemocyanin působí jako nosič kyslíku u členovců a měkkýšů.
krystalové struktury tyrosinase ze Streptomyces castaneoglobisporus HUT 620268 monoaminooxidázy a katechol ze sladkých brambor Ipomoea batatas180 byly určeny. Potvrzují, že koordinace místa mědi typu 3 v tyrosináze a katecholoxidáze je velmi podobná koordinaci v hemocyaninu. To bylo dříve odvozeno z podobnosti spektroskopických vlastností a srovnání mnoha primárních struktur tyrosinázy a hemocyaninu.181-183 na základě biologického zdroje proteinů bylo možné identifikovat sedm různých doménových organizací. Rostlinné katecholoxidázy různých organismů mají sekvenční identitu asi 40-60%. Identita sekvence mezi katecholoxidázami a mulluscanovými hemocyaniny je asi 35% po téměř celé délce sekvencí. Naproti tomu identita sekvence mezi rostlinnými katecholoxidázami a jinými měďnatými proteiny typu 3 z jakéhokoli zdroje bez rostlin je omezena na dvě oblasti vázající měď.
dvě oblasti vázající měď vykazují nejvyšší konzervaci ve všech proteinech mědi typu 3. Zejména region závazné Mládě je vysoce konzervovaným, vzhledem k tomu, že Čzu-závazné regionu ukazuje více sekvence řadu a byl zodpovědný za různé funkce tyrosinase, katechol monoaminooxidázy, a hemocyanin.
celková struktura tyrosinázy ze s. castaneoglobisporus v komplexu s otevřeným čtecím rámcem ORF378 je zobrazen na obrázku 23. Tyrosináza má α-spirálové struktury s jádrem enzymu, které je tvořeno čtyřšroubovicovým svazkem. Centrum katalytické dinukleární mědi je uloženo ve spirálovitém svazku (obrázek 23). Každý ze dvou iontů mědi v aktivním místě je koordinován třemi jeho zbytky (obrázek 24), které jsou odvozeny ze čtyř spirál α-svazku kromě His54. Jeden ion mědi (označený CuA) je koordinován His38, His54 a His63. His38 a His63 jsou umístěny uprostřed α2 a α3. Druhý ion mědi (CuB) je koordinován His190, His194 a His216. Zbytky His190 a His194 jsou na začátku a uprostřed α6, respektive, a His216 je uprostřed α7. Toto středové centrum je umístěno ve spodní části velké konkávnosti jako domnělá kapsa vázající substrát, která je tvořena hydrofobními zbytky. Kromě spirálové struktury má tyrosináza několik β-struktur, jak je posuzováno z úhlů torze páteře. V nich tvoří pouze N-A C-terminální β-prameny listovou strukturu.
obrázek 23. Stuha schéma tyrosinase ze Streptomyces castaneoglobisporus v komplexu s ORF378 (PDB-kód: 1WX3). Tyrosináza a ORF378 jsou zobrazeny v růžové a malinové barvě. Ionty mědi CuA a mládě jsou zobrazeny jako žluté koule; připravené Pymolem (W. L. DeLano, Palo Alto, 2003).
obrázek 24. Met formě aktivního centra tyrosinase ze Streptomyces castaneoglobisporus (PDB-kód: 1WX3); připravené s PyMOL (W. L., DeLano, Palo Alto, 2003).
i když sekvence aminokyselin tyrosinase má pouze 25.3 a 26.0% identitu s těmi, I. batatas katechol oxidase180 a odg domény Chobotnice dofleini hemocyanin,184, respektive, jeho celková struktura je velmi podobná jejich. Mezi těmito třemi proteiny je pozorován vysoký stupeň konzervace v jádrové doméně složené z α-svazku. Tyrosináza a hemocyaniny z panulirus interruputus185 a L. polyphemus66 nevykazují žádnou významnou homologii a žádnou podobnost ve svých strukturách, ale katalytické jádrové domény těchto proteinů jsou superponovatelné.
pro tyrosinázu ze s. castaneoglobisporus lze v krystalových strukturách charakterizovat pět různých stavů aktivního místa, a to formu bez mědi, met formu i, met formu II, deoxy a oxy. V krystalových strukturách katechol oxidázy z I. batatas byly objasněny stavy met a deoxy, jakož i komplex inhibitorů. Ve stavu met (Cu(II), Cu(II)) jsou dva měďnaté ionty ve vzdálenosti 2.9 Å, z nichž každý je koordinován třemi histidiny. Jsou dodány od jiného atomu, s největší pravděpodobností sodný ion, ve vzdálenosti asi 1,8 Å z každé měďnatými ion, tak, že každý z nich má koordinační číslo 4 (viz Obrázek 24, který znázorňuje stejnou situaci pro tyrosinázu od S. castaneoglobisporus). V deoxy nebo redukovaném stavu jsou oba atomy mědi v oxidačním stavu +1. Vzdálenost měď-měď je 4,4 Å. Koordinační čísla jsou 4 na Čzu (tři histidin ligandy a koordinační molekuly vody) a 3 CuB (tři histidin ligandy). Koordinační sféra je narušena trigonal pyramidální pro CuA a náměstí rovinnou pro Mládě (koordinační místo obsazené překlenovací OH− v met státu je prázdný). V inhibitorem komplexu s phenylthiourea (PTU), měď–měď vzdálenost se zvyšuje na 4,2 Å s atom síry PTU výměna hydroxo mostu potkal státu. Koordinační sféry obou mědirytů zůstávají podobné oblastem STH, ale dochází ke konformačním změnám na reziduích aktivního místa. Nejvýznamnější změnou je rotace aromatického kruhu Phe261(číslování katecholoxidázy).
ve srovnání se stavem met mají koordinační zbytky ve redukovaném stavu jen mírně odlišné polohy, což naznačuje poměrně tuhou kapsu. Změny v koordinaci jsou spojeny s pohyby atomů mědi v kapse. Komplex inhibitorů ukazuje, že Phe261 je umístěn nad aktivním místem jako brána, která se otáčí po vazbě inhibitoru. Zdá se tedy, že přístup substrátu ke středu katalytického kovu je řízen tímto „zbytkem brány“.
katalytický mechanismus tyrosinázy byl poprvé podrobně studován Solomonem et al.178 Solomon navrhl mechanismus jak pro aktivity tyrosinázy, tak katecholázy (obrázek 25). Tento mechanismus naznačuje, že oxyový stav je výchozím bodem aktivity kresolázy (vnitřní kruh). Tento stav je přítomen v klidové formě tyrosinázy v poměru asi 15% (85% met stav). Monofenolový substrát se váže na kyslíkový stav a je monooxygenován na o-difenol. Tento diphenol následně se váže na měď centru potkal tyrosinázy v dvojvazný závazný režim navržena na základě modelu sloučeniny.188 oxidace difenolového substrátu vede ke sníženému stavu dinukleárního měděného centra. Reoxidace redukovaného stavu do kyslíkového stavu nastává napadením dioxygenu a uzavírá katalytický cyklus.
obrázek 25. Mechanismus cresolase a catecholase činnost tyrosinázy monoaminooxidázy a katechol vyvinut na základě původního návrhu Solomon a coworkers178 a více, včetně posledních výsledků.186,187 reprodukováno od C. Gerdemanna; C. Eicken; B. Krebs, Acc. Cheme. Res. 2002, 35, 183-191, se svolením American Chemical Society.
mechanismus aktivity katecholázy (vnější kruh) začíná od stavů oxy a met. Difenolový substrát se váže na stav met (například), následovaný oxidací substrátu na první Chinon a tvorbou redukovaného stavu enzymu. Vazba dioxygenu vede k kyslíkovému stavu, který je následně napaden druhou molekulou difenolu. Oxidace na druhý Chinon znovu vytvoří stav met a uzavře katalytický cyklus.
Alternativní reakční mechanismy zahrnují radikální mechanismus navržený Kitajima a Morooka189 a mechanismus zahrnující Cu(III) střední založené na měření modelu sloučenin.190 na základě krystalové struktury komplexu inhibitorů katechol oxidáza-PTU byla navržena monodentátová vazba substrátu pro katecholoxidázu.180 radikální mechanismus, jak je navrženo pro slabé catecholase činnost nalezen v Octopus vulgaris hemocyanin,191 je také možné, pro katechol monoaminooxidázy vzhledem k silné strukturální vztah mezi katechol monoaminooxidázy z I. batatas a odg hemocyanin, jak je popsáno výše.
zřetelný rozdíl mezi katecholoxidázou a tyrosinázou nebyl dosud vysvětlen. Byla zjištěna a studována fáze mas v monofenolázové aktivitě tyrosinázy a navrhuje se, aby byla výsledkem dočasné inhibice met stavu tyrosinázy nadbytkem monofenolového substrátu (obrázek 25).186 aktivita Monofenolázy se zvyšuje, když difenolový produkt vytlačuje monofenol z methyrosinázy a umožňuje pokračování katalytického cyklu. Katecholoxidáza ve své izolované formě je přítomna výhradně v met stavu a je také inhibována fenolem. Bylo proto navrženo, že nedostatek oxyového stavu je důvodem, proč katecholoxidáza postrádá aktivitu kresolázy. Protože oxy katechol oxidáza také nevykazuje žádnou aktivitu monooxygenázy, toto vysvětlení se nezdá být zcela uspokojivé. Dalším možným důvodem je, že přístup k CuA, který byl navržen, aby byl nezbytný pro okysličení monofenoly,192 je blokován v krystalové struktuře katechol monoaminooxidázy z I. batatas.