Clostridium difficile Toxin B
Wenn der katalytische Threoninrest der Glucosyltransferase eine Familie kleiner GTPasen, z. B. die Rho-Familie, deaktiviert; Rac und Cdc42 in den Zielzellen stören die Signaltransduktionsmechanismen, was zu Funktionsstörungen des Aktin-Zytoskeletts, des Zell-Zell-Übergangs und der Apoptose führt (Abb. 5). Rho induziert die Aktivität von Aktin-Stressfasern. Rac Proteine steuert die Aktivitäten der Membran Kräuseln und NADPH-Oxidase neutrophile. Cdc42 reguliert die F-Aktin-Filamentbildung in Filopodien.
Zytotoxizitätbearbeiten
Abbildung 3: Toxin B verändert die Dynamik der Zellstruktur. Bilder von REM: a) Kontrollzellen und b) Zellen, die 18 Stunden mit TcdB behandelt wurden. Schwarzer Pfeil zeigt die Position der Zelloberfläche Blebbing.
Mehrere Studien haben gezeigt, dass das Vorhandensein von TcdB in Säugetierzellen zu schnellen Veränderungen in der Zellmorphologie und Zellsignalisierung führt. Innerhalb kurzer Zeit haben Zellen das Aussehen von Plaque mit kleinen Dosierungen von TcdB und TcdA. Darüber hinaus ist der Tod der Zellen ein wesentlicher Einfluss dieser Toxine, nachdem die Zellen berauscht wurden. Eine Untersuchung von Donta et al. zeigt, dass TcdB schwerwiegende Auswirkungen auf andere Säugetierzellen wie Eierstockzellen des chinesischen Hamsters, humane Zervixepithelzellen, Nebennierenzellen der Maus, Rattenhepatozyten und Rattenastrozyten hat (Abb.3).
Die zytotoxische Aktivität basiert auf Zelltypen, die von 4-fach bis 200-fach reichen können. Wenn Zellen mit TcdB infiziert werden, verlieren sie im Allgemeinen nicht nur ihre strukturelle Integrität, sondern auch die F-Aktin-Filamente. Zellrundungen durch TcdB dauern nicht länger als 2 Stunden (Abb. 4), aber was den Zelltod betrifft, kann es ungefähr 24 Stunden dauern. In Bezug auf Clostridium difficile-assoziierte Diarrhoe (CDAD) sind die Auswirkungen der Zytopathizität kritischer als der tatsächliche Zelltod, da Zellen, sobald sie die Integrität des Aktinfilaments des Zytoskeletts verlieren, auch ihre normale Funktion verlieren.
Abbildung 4: Auswirkungen von Toxin B auf Rattenastrozyten. Dies ist eine wahrscheinliche Illustration von Rattenastrozyten, die mit 100 ng / ml Toxin B für 2 Stunden bei 37 ° C inkubiert wurden.
Auswirkungen auf kleine GTPASEBEARBEITEN
Die Ursache für die zytotoxische Aktivität von TcdB innerhalb der Wirtszelle wird hauptsächlich über die Rezeptorendozytose vermittelt. Saure Endosomen lassen Toxin B in das Zytosol gelangen. Dieses Phänomen findet durch eine Bindungsrezeptorregion statt, die es Toxin ermöglicht, in Wirtszellen einzudringen. Durch die Zugänglichkeit des Cytosols der Wirtszellen deaktiviert TcdB die kleinen GTPasen (Abb. 5), z.B. die Rho-Familienmitglieder Rac und Cdc42 durch den Prozess der Glykosylierung von Threonin 35 in Cdc42 und Rac und Threonin 37 in Rho. Diese Rho-GTPasen kommen ubiquitär im Cytosol eukaryotischer Zellen vor, die für die Organisation des Aktin-Zytoskeletts verantwortlich sind, da die Toxine im Cytosol eine Kondensation von Aktinfilamenten als Folge von Zellrundung und Membranblasen verursachen (Abb. 3), was letztendlich zur Apoptose führt. TcdB verursacht kritische Veränderungen der Zelldynamik und -morphologie. Abbildung 3 zeigt die wahrscheinliche Wirkung von Toxin B auf die Oberfläche einer Zelle; Membran Blebbing (schwarze Pfeile). Darüber hinaus inaktiviert TcdB Rho-GTPasen. Infolgedessen werden Zell-Zell-Verbindungen gestört, was die epitheliale Permeabilität von Toxin B und die Flüssigkeitsansammlung im Lumen erhöht. Dies ist einer der Hauptverursacher der Clostridium difficile-assoziierten Diarrhoe (CDAD)(Abb. 5).
Abbildung 5: Intrazelluläre Modifikationen durch TcdB. Erstens bindet Toxin B an die Oberfläche der Zelle und wird durch rezeptorvermittelte Endozytose internalisiert. Zweitens löst die Ansäuerung des Endosoms die Bildung einer Pore aus, durch die die GTD transloziert wird. Drittens hilft die Aufnahme durch UDP-Glucose, an die GTPasen zu binden und in das Cytosol freizusetzen. Schließlich, die GTD Glucosylate Rho Familie GTPasen an der Zellmembran und Kontrolle Transkriptionsregulation und schließlich Apoptose der Zelle.
Darüber hinaus ist die Hydrolyserate von UDP-Glucose durch TcdB ungefähr fünffach größer als TcdA. Mehrere Studien haben gezeigt, dass Rho posttranslationale Modifikation durch Prenylierung und Carboxymethylierung zeigt, die in der zytoplasmatischen Seite der Plasmamembran auftritt, daher der Austausch von GTP zu GDP. Wenn TcdB an Rho und andere kleine GTPasen bindet, hydrolysiert GTP zu GDP, was zu GTP-gebunden (aktiv) zu GDP-gebunden (inaktiv) führt (Abb. 5). Darüber hinaus wird diese Austauschaktivität durch Guaninfaktoren im Zytosol der Zelle reguliert.
Störung auf Signalwegenbearbeiten
Die zelluläre Regulation von Rho, Rac und Cdc42 hat Auswirkungen außerhalb der Nähe der Aktinfilamente des Zytoskeletts (Abb. 4) werden diese kleinen GTPasen in den Zellzyklus eingebaut, der Signale über mitogenaktivierte Proteinkinase-Kinasen (MAPKKs) reguliert. Einige physiologische Teile der Zellen, die nicht an Aktinfilamenten beteiligt sind, verursachen möglicherweise nicht sofort eine Zellrundung oder einen Zelltod, sondern können bei der Aktivität des nachgeschalteten Signalwegs zur Verschlechterung der Aktinfilamente und schließlich zum Zelltod führen.
1993 wurde eine Studie von Shoshan et al., zeigte, dass Zellen mit TcdB die Aktivität der Phospholipase A2 veränderten. Dies war ein unabhängiges Ereignis von der Störung des Aktin-Zytoskeletts. Shoshan et al., zeigte auch, dass TcdB die Rezeptorsignalaktivität hemmte, indem es die Rho-Proteine über Phospholipase D deaktivierte.
Porenbildungbearbeiten
TcdB greift durch Clathrin-vermittelte Endozytose auf das Innere der Zelle zu, Wenn Toxin B Teil des Cytosols ist, passiert die Glucosyltransferase die endosomale Membran, die den pH-Wert senkt, die Translokation induziert und schließlich zu morphologischen Veränderungen der Translokationsregionsreste führt (958-1130). Die hydrophoben Bereiche sind in die Wirtsmembran eingebettet, um Poren zu bilden, die den Durchgang von Glucosyltransferase-Domänen ermöglichen. Wenn Zellen mit TcdB in einer sauren Umgebung infiziert sind, dämpft es Toxine und verursacht Formumlagerungen (Abb. 6). Als Folge des sauren pH-Wertes zeigt TcdB deutliche Unterschiede in der ursprünglichen Fluoreszenz von Tryptophan, der Empfindlichkeit von Proteasen und hydrophoben Oberflächen. Eine andere Gruppe hat gezeigt, dass die Versauerung zu Konformationsänderungen des Toxins führt und, was noch wichtiger ist, zur Bildung von Poren beiträgt. Ein mutmaßlicher Translokationsbereich (Fig. 2) macht etwa 801-1400 Aminosäuren aus, von denen die Reste 958-1130 hydrophob sind und für die Bildung von Transmembranporen verantwortlich sind. Ein Großteil der Studien verwendete den TcdB-Stamm 630, um die Porenbildungsaktivität von C. difficile-Toxinen zu zeigen.
Induziert durch pHEdit
Um zu sehen, ob Effekte der proteolytischen Spaltung von TcdB an der Zelloberfläche oder in sauren Endosomen stattfinden, verwendeten Studien Bafilomycin A1, von dem bekannt ist, dass es die v-Typ H + -ATPasen von Endosomen blockiert. Dies reduziert den Säuregehalt in Endosomen. Der physiologische Aufnahmepfad von TcdB verhindert die zytopathische Aktivität von TcdB. Wenn Zellen nach der Bindung von TcdB an die Zelloberfläche bei 37 Grad Celsius 5 Minuten lang unter sauren Bedingungen (pH 4,0) waren, wurden die Formumlagerungen und -rundungen beobachtet. Wenn jedoch gerundete Zellen für eine weitere Stunde in neutralem pH-Wert (7,0) mit ähnlichen Parametern inkubiert wurden, wurde keine Zellrundung beobachtet. Beide Studien zeigten, dass Toxin B eine Eigenschaft der proteolytischen Spaltung aufweist, die für den Zugang zum Cytosol entscheidend ist. Ein saurer pH-Wert des Endosoms führt zu topologischen Veränderungen der TcdB (Abbildung 6).
Abbildung 6: Organisationsdomäne von TcdB.Zeigt den Unterschied zwischen neutralem und saurem pH-Wert (4).
Das Gen, das für das TcdB-Protein tcdB kodiert, befindet sich innerhalb der chromosomalen Region von 19,6 kb. Dies wird als Pathogenitätsort oder PaLoc bezeichnet (Abbildung 2). Der offene Leserahmen (ORF) für tcdB ist 7.098 Nukleotide lang. Es ist wichtig zu erwähnen, dass es neben den wichtigsten Toxingenen in der PaLoc-Region drei weitere akzessorische Gene gibt, die in der PaLoc-Region kodieren: tcdR (L), tcdC (R) und tcdE in der Mitte. Diese Gene helfen, die TCDA- und TcdB-Expression zu regulieren. Sie helfen auch, die Giftstoffe aus der Zelle abzusondern oder freizusetzen. Das kodierende Gen tcdE, das sich zwischen tcdB und tcdA befindet, ist analog zu Holinproteinen, daher wird vorgeschlagen, dass tcdE als Vermittlergen wirkt, das die Freisetzung oder Sekretion von TcdA und TcdB verstärkt, wodurch die Permeabilität der Wirtszell-Membran erhöht wird.
Abbildung 2: Archetypischer Pathogenitätslocus (PaLoc), der für die an C beteiligten großen Clostridien-Toxine (LCTs) kodiert. difficile Infektionen CDI.
Es gibt verschiedene Plasmidgrößen von C. difficile. Die nachgewiesenen Molekulargewichte reichen von 2,7×106 bis 100×106, Plasmidgrößen zeigen jedoch keine Korrelation mit der Toxizität. Um den Toxin-B-Spiegel in C. difficile nachzuweisen, verwenden Kliniker in großem Umfang Zellkulturtests, die aus Stuhlproben von Patienten mit PMC stammen. Der Zellkulturtest gilt als „Goldstandard“ für den Nachweis von Toxizität bei C. difficile, da eine geringe Menge Toxin B eine Zellrundung verursachen kann (Abb. 4) ist es daher ein großer Vorteil klinischer Laboratorien, Korrelationen mit der durch TcdB verursachten CDAD herzustellen. Obwohl die zytotoxische Aktivität großer Clostridien-Toxine (LCTs) in Stuhlproben von PMC-Patienten gefunden wurde, hatte die Toxin-B-Aktivität im Vergleich zu Toxin A schädlichere zytotoxische Wirkungen. Daher ist die Aktivität von Toxin A abgeschwächt, wenn es nicht aus Toxin B isoliert wird. Der Nachweis der C. difficile-Toxizität ist äußerst empfindlich, jedoch ermöglicht die Verwendung des Zellkulturtests klinischen Labors, die Herausforderung; die Verwendung von Dosen von nur 1 pg / ml Toxin B reicht aus, um eine Zellrundung zu verursachen. Dies ist der Hauptvorteil bei der Verwendung des Kulturgewebetests zum Nachweis von Toxizität bei PMC-Patienten. Obwohl klinische Labors versucht haben, einen Assay-Mikrotiterplatten-Enzym-Linked-Immunosorbent-Assay (ELISA) und andere Techniken zum Nachweis der zytotoxischen Aktivität von Toxin B im Kot von PMC-Patienten zu verwenden, sind die Ergebnisse nicht so genau wie diejenigen, bei denen Zellkulturtests verwendet wurden.
Produktionsfaktorbearbeiten
Durch Hinzufügen von Daten, z. clindamycin, in das Kulturwachstumsmedium, Studien haben gezeigt, dass die zytotoxische Aktivität in C. difficile-Kulturen um das 4-8-fache zunimmt. Darüber hinaus zu wissen, die Rolle von Antibiotika auf die Ursachen von PMC, viele frühere Studien konzentrierten sich auf die Auswirkungen von antimikrobiellen Mitteln Produktion von Toxinen. Als Ergebnis konnten Studien den Schluss ziehen, dass die subinhibitorische Natur von Vancomycin und Penicillin die Toxinproduktion in Kulturen von C. difficile erhöht. Die Mengen der Toxinproduktion korrelierten mit der Verwendung von Wachstumsmedium für die Organismen. Eine andere Studie zeigte, dass die hohe Toxinproduktion von TcdB in komplexen Medien wie Gehirn- und Herzinfusionsbrühe beobachtet wurde. Hohe Konzentrationen von Toxinen wurden mit Isolierung von hoch virulent produziert. Umgekehrt wurden niedrige Konzentrationen von Toxinen mit Isolierung von schwach virulent produziert. Somit zeigt es, dass die Produktion von Toxinen mitreguliert wurde. Obwohl der Mechanismus hinter der Beteiligung der Umwelt an der Modulation der Signale, die die Toxine exprimieren, nicht verstanden wird, haben In-vitro-Studien gezeigt, dass die Expression von Toxin durch katabolische Repression und Stress, z. B. Antibiotika, verstärkt wird. Eine andere Studie hat gezeigt, dass die Begrenzung von Biotin in gut charakterisiertem Medium die Produktion von TcdB um das 64-fache und TcdA um das 35-fache erhöht. Dies geschah mit C. difficile und Dosen von Biotin so klein wie 0,05 nM. Mehrere andere frühe Studien haben gegen die Theorie argumentiert, dass die Produktion von Toxin etwas mit Stress oder katabolischer Repression von Toxin TcdA oder TcdB zu tun hat. Viele Studien sagen auch, dass der Hauptgrund für die Unterschiede zwischen anderen Studien auf die Toxinproduktion zurückzuführen ist, die nicht bei allen Isolaten von C. difficile auftritt.