Etablierung eines kompetitiven Bindungsassays zur Identifizierung der verschiedenen Eigenschaften neutralisierender Epitope des Hepatitis-E-Virus

Abstract

Ziele: Bestätigung der verschiedenen Eigenschaften genotypspezifischer und gängiger neutralisierender Epitope des Hepatitis-E-Virus (HEV). Methoden: Ein kompetitiver Bindungsassay wurde mit bekannten genotypspezifischen neutralisierenden monoklonalen Antikörpern (mAbs) 3G1 und 5G5 sowie genotypspezifischen neutralisierenden mAbs 2B1 und 4C5 etabliert. HEV ORF2 rekombinantes p166W01 abgeleitet von Genotyp 1 und p166Chn abgeleitet von Genotyp 4 wurden als beschichtete Antigene verwendet, um zu bestimmen, ob die mAbs unabhängige, ähnliche oder überlappende Epitope erkennen. mAbs wurden hergestellt, gereinigt und mit Meerrettichperoxidase (HRP) konjugiert. HRP-konjugiertes 2B1 konnte nur mit p166W01, aber nicht mit p166Chn reagieren, HRP-konjugiertes 4C5 konnte nur mit p166Chn, aber nicht mit p166W01 reagieren, während HRP-konjugiertes 3G1 und 5G5 sowohl mit P166W01 als auch mit P166CHN reagieren konnten. Daher wurden nacheinander kompetitive Bindungsassays unter Verwendung von p166W01- und p166Chn-Antigen durchgeführt. Ergebnisse und Schlussfolgerung: Die Ergebnisse kompetitiver Bindungsassays zeigten, dass die Bindung von HRP-konjugiertem 2B1 an p166W01 nicht durch 5G5 oder 3G1 inhibiert werden konnte. In ähnlicher Weise konnte die Bindung von HRP-konjugiertem 4C5 an p166Chn nicht durch 5G5 oder 3G1 inhibiert werden. Die mAbs 5G5 und 3G1 blockierten jedoch die gegenseitige Bindung an p166W01 und p166Chn, was darauf hindeutet, dass gängige und genotypspezifische neutralisierende mAbs unabhängige Epitope erkennen.

© 2018 S. Karger AG, Basel

Einleitung

Das Hepatitis-E-Virus (HEV) ist ein nicht umhülltes Positiv-Strang-RNA-Virus, das hauptsächlich oral übertragen wird und beim Menschen eine akute Hepatitis E verursacht. Eine HEV-Infektion kann zu nachteiligen Prognosen führen, beispielsweise zu Lebensversagen, schwerer akuter Hepatitis, chronischer Infektion des transplantierten Organs und bei immunsupprimierten Patienten und hoher Mortalität bei Schwangeren . Neben der bestätigten Infektion beim Menschen infizieren HEVs auch Tiere und können von Tieren auf Menschen übertragen werden; Die Inzidenz von Hepatitis-E-Infektionen in den Industrieländern hat ebenfalls erheblich zugenommen . Diese Ergebnisse zeigen, dass HEV weltweit eine Bedrohung für die öffentliche Gesundheit darstellt .

Obwohl ein Serotyp erkannt wurde, konnten HEV-Isolate, die aus verschiedenen Gebieten auf der ganzen Welt stammen, in 4 Hauptgenotypen eingeteilt werden . HEVs der Genotypen 1 und 2 unterscheiden sich von den Genotypen 3 und 4 in ihren epidemiologischen, antigenen und immunogenen Eigenschaften .

Bisher ist die Forschung zur antigenen Epitopcharakterisierung, die hauptsächlich auf dem HEV-Strukturprotein für ein In-vitro-Kultursystem basiert, nicht verfügbar . pORF2 ist das wichtigste HEV-Strukturprotein, das von ORF2 codiert wird, das 1 von 3 überlappenden offenen Leserahmen (ORFs) des viralen Genoms darstellt . Vorherrschende immunogene Regionen von pORF2 wurden in der C-terminalen 2/3-Region lokalisiert, die die Hauptziele der Impfstoffentwicklung waren .

Unsere vorherige Studie hat die Existenz eines Immunogenitätsunterschieds zwischen dem Hepatitis-E-Impfstoff p179 (439-617 Aminosäuren des ORF2-Proteins) aus Genotyp 4 und p239 (Hecolin) aus Genotyp 1 gezeigt, der Unterschied kann auf das Vorhandensein von HEV-Genotyp-spezifischen Epitopen zurückzuführen sein . Monoklonale Antikörper (mAbs), die in Mäusen hergestellt wurden, die jeweils mit p166Sar (452-617 Aminosäuren des ORF2-Proteins) aus Genotyp 1 und p166Chn aus Genotyp 4 immunisiert wurden, wurden verwendet, um das Vorhandensein von geotypspezifischen Epitopen zu bestätigen. Neben 2 genotypspezifischen neutralisierenden mAbs, 3G1 und 5G5, wurden auch 2 genotypspezifische neutralisierende mAbs, 2B1 und 4C5, erhalten. 2B1 gegen p166Sar konnte spezifisch an rekombinante Proteine der Genotypen 1 und 2 binden und neutralisierte in vitro nur Stämme der Genotypen 1 und 2; 4C5 gegen P166CHN immunreagierte spezifisch gegen rekombinante Proteine des Genotyps 3 und 4 und neutralisierte nur Stämme des Genotyps 3 und 4, während 3G1 gegen p166Sar und 5G5 gegen p166Chn an rekombinante Proteine des Genotyps 1-4 binden und Stämme des Genotyps 4 neutralisieren konnten . Zur weiteren Untersuchung der verschiedenen Eigenschaften von Genotyp-gemeinsamen und Genotyp-spezifischen neutralisierenden Epitopen von HEV wurde ein kompetitiver Bindungsassay unter Verwendung der mAbs 2B1, 3G1, 4C5 und 5G5 entwickelt, um zu bestätigen, ob die von mAbs erkannten Epitope unabhängig, ähnlich oder überlappend sind.

Materialien und Methoden

Rekombinante Proteine

Rekombinantes p166 war ein verkürztes Protein von pORF2, die Nukleotidsequenzen wurden von den folgenden HEV-Stämmen abgeleitet: W01 (Genotyp 1, JX857689) und China-9829 (Genotyp 4, AY789225). Rekombinante Plasmide wurden konstruiert und in Escherichia coli exprimiert . Die 2 His-markierten p166-Proteine wurden als p166W01 bzw. p166Chn bezeichnet.

mAb-Produktion

Insgesamt 4 neutralisierende mAbs, 2B1, 3G1, 4C5 und 5G5, die zuvor beschrieben wurden, wurden verwendet, um einen kompetitiven enzymgebundenen Immunosorbens-Assay (ELISA) zu entwickeln. 2B1 und 3G1 wurden gegen p166Sar erhoben; 4C5 und 5G5 wurden gegen p166Chn erhoben. Die mAbs wurden durch Injektion von 106 Hybridomzellen in die Peritonealhöhle einer BALB / c-Maus hergestellt; Aszitesflüssigkeit, die mAbs enthielt, wurde nach 7-10 Tagen geerntet, filtriert, zentrifugiert und bei -80 ° C gelagert.

Reinigung von mAbs

Die MAB-Aszites-Flüssigkeit wurde mittels Protein-G-Sepharose-Säulenaffinitätschromatographie (Sigma, Deutschland) gereinigt. Antikörperhaltige Fraktionen wurden mit dem sauren Elutionspuffer (0,1 M Glycin-HCl, pH 2,8) aus dem immobilisierten Protein G gesammelt und anschließend bei 280 nm bestimmt; die Extinktion bei 280 nm (A280) kann zur groben Quantifizierung der mAbs verwendet werden. Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese wurde verwendet, um die gereinigten Fraktionen unter Verwendung von Rinderserumalbumin zu bestätigen und zu quantifizieren.

Kopplung von Meerrettichperoxidase an mAbs

Gereinigte mAbs wurden gegen 100 mM Carbonat/Bicarbonat-Puffer (pH 9,3) bei 4°C über Nacht dialysiert. Antikörper wurden nach Herstellerangaben (KPL) an Meerrettichperoxidase (HRP) gekoppelt. Etwa 1,5 mg HRP wurden mit 0,5 mg mAb in 0,5 ml Gesamtvolumen HRP-Konjugationspuffer durch leichtes Rühren bei Raumtemperatur für 1 h gemischt. Nach Zugabe von 10 µl des Reduktionsmittels wurde 15 min bei Raumtemperatur belassen und dann 1 Volumen destilliertes Glycerin zur Lagerung und weiteren Verwendung zugegeben.

Kreuzreaktivität von HRP-konjugierten mAbs zu heterologem p166-Antigen

Die ELISA-Methode wurde angewendet, um die Kreuzreaktivität von HRP-konjugierten mAbs mit p166W01 und p166Chn-Antigen zu bestätigen . Kurzzeitig wurden Vertiefungen von Mikroplatten mit 100 ng des p166W01- bzw. p166Chn-Antigens beschichtet und für 2 h bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden beschichtete Antigene entfernt; in Vertiefungen wurden 200 µL phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 0,1% Rinderserumalbumin zugegeben und anschließend Mikroplatten bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubiert. Zwei Stunden später wurde der Blockierpuffer verworfen und die Vertiefungen zweimal mit PBS mit 0,05% Tween-20 (PBST) gewaschen. Serielle 2-fache Verdünnungen von HRP-konjugierten mAbs im Bereich von 1: 400 bis 1: 25.600 in 1% Casein PBS wurden in entsprechenden Vertiefungen zugegeben, gefolgt von 45 min Inkubation bei 37 °C; Casein PBS wurde durch 5-maliges Waschen mit PBST entfernt. Tetramethylbenzidin-Flüssigsubstrat wurde zur Farbentwicklung zur Inkubation bei 37°C für 10 min zugegeben. Schließlich wurde die optische Dichte (OD) jeder Vertiefung bei 450 nm mit einer Referenzwellenlänge von 630 nm abgelesen.

Bestimmung von Antigen- und mAb-Titern

Die Titer von Antigen und MAB wurden mittels eines ELISA bestimmt. Anfänglich wurden serielle 2-fache Verdünnungen von HRP-konjugierten mAbs im Bereich von 1: 400 bis 1: 25.600 in 1% Casein-PBS hergestellt und dann zu Vertiefungen gegeben, die mit seriellen Verdünnungen von p166W01 oder p166Chn-Antigen vorbeschichtet waren. Nach einer 45-minütigen Inkubation bei 37°C wurden ungebundene MAK durch 5-maliges Waschen mit PBST entfernt. Tetramethylbenzidin-Flüssigsubstrat wurde zur Farbentwicklung für eine 10-minütige Inkubation bei 37°C zugegeben. Schließlich wurde die OD jeder Vertiefung bei 450 nm mit einer Referenzwellenlänge von 630 nm abgelesen, um die Verdünnung zu bestimmen, die untersättigte, und ergab einen OD-Wert von ungefähr 1,0 bei 450 nm mit einer Referenzwellenlänge von 630 nm.

Kompetitiver Bindungsassay

Die unterschiedlichen Charakteristika von gemeinsamen und genotypspezifischen neutralisierenden Epitopen von HEV wurden unter Verwendung eines paarweisen kompetitiven Bindungsassays untersucht, der mit gemeinsamen und genotypspezifischen neutralisierenden mAbs etabliert wurde. Die Methoden ähnelten den oben beschriebenen Verfahren, mit der Ausnahme, dass p166W01 bzw. p166Chn als Beschichtungsantigen verwendet wurden und Mischungen von HRP-konjugiertem mAb in doppelter Konzentration und einer gesättigten Konzentration von nicht konjugiertem mAb zu den beschichteten Vertiefungen gegeben wurden. Die OD wurde bei 450 nm mit einer Referenzwellenlänge von 630 nm gemessen. Die prozentuale Hemmung wurde nach der Formel berechnet: 100 × . Die Konkurrenz wurde als positiv bewertet, wenn der Hemmungsprozentsatz mehr als 50% betrug.

Ergebnisse

Kreuzreaktivität von HRP-konjugierten mAbs zu heterologem p166-Antigen

Die ELISA-Methode wurde angewendet, um die Kreuzreaktivität von HRP-konjugierten mAbs zu p166W01- und p166Chn-Antigenen zu bewerten. Die Ergebnisse zeigten, dass HRP-konjugiertes 2B1 bei Verdünnungen von 1: 400 bis 1: 25.600 nur mit P166W01, aber nicht mit p166Chn und HRP-konjugiertes 4C5 bei Verdünnungen von 1: 400 bis 1: 25.600 nur mit P166CHN reagierte. Im Gegensatz dazu reagierten HRP-konjugiertes 3G1 und 5G5 in Verdünnungen von 1: 400 bis 1: 25.600 gut mit den 2 p166-Proteinen (Abb. 1). Diese Beobachtungen ähnelten den vorherigen Befunden, 2B1 und 4C5 sind genotypspezifische mAbs, während 3G1 und 5G5 genotypspezifische mAbs sind .

Bestimmung von p166W01-Antigen und HRP-konjugierten mAb-Titern für den kompetitiven Bindungsassay

p166W01-Antigen wurde verwendet, um den kompetitiven Bindungsassay von mAbs 2B1, 3G1 und 5G5 zu etablieren; Die richtigen Titer von mAbs und Antigen wurden unter Verwendung von ELISA bestimmt. Wie in Tabelle 1 gezeigt, betrug der mittlere OD-Wert nach der Quadrattitration, wenn die Verdünnung des p166W01-Antigens 1: 400 betrug, HRP-konjugiertes 2B1 1: 6.400 nahe 1,0. Wie in Tabelle 2 gezeigt, betrug die Verdünnung des Antigens 1: 400, HRP-konjugiertes 5G5 und HRP-konjugiertes 3G1 1: 6.400 bzw. 1: 12.800, und der mittlere OD-Wert lag nahe bei 1,0.

Bestimmung von p166Chn-Antigen und HRP-konjugierten mAb-Titern für den kompetitiven Bindungsassay

p166Chn-Antigen wurde verwendet, um den kompetitiven Bindungsassay von mAbs 4C5, 3G1 und 5G5 zu etablieren, die richtigen Titer von mAbs und Antigen wurden ebenfalls unter Verwendung von ELISA bestimmt. Wie in Tabelle 3 gezeigt, betrug HRP-konjugiertes 4C5 nach quadratischer Titration, wenn die Verdünnung des p166Chn-Antigens 1: 800 betrug, 1: 6.400 und der mittlere OD-Wert lag nahe bei 1,0. Wie in Tabelle 4 gezeigt, betrug die Verdünnung des Antigens 1: 800, die Verdünnungen von HRP-konjugiertem 5G5 und HRP-konjugiertem 3G1 1: 6.400 bzw. 1: 12.800; Der mittlere OD-Wert lag nahe bei 1,0.

Hemmung der Bindung von mAbs an p166W01

Die Ergebnisse der Hemmung sind in Tabelle 5 dargestellt; die Bindung von HRP-konjugiertem 2B1 an p166W01-Antigen wurde durch unkonjugiertes 2B1 mit 68% iger Hemmung inhibiert. Es gab keine signifikante Hemmung zwischen 2B1 mit mAbs 5G5 und 3G1 (27 und 30%). Eine vollständigere Hemmung wurde von heterologen mAbs 3G1 und 5G5 erhalten, denn die Bindung von HRP-3G1 an Antigen wurde durch 5G5 mit 61% Hemmung gehemmt, HRP-konjugiertes 5G5 an Antigen wurde durch 3G1 mit 99% Hemmung gehemmt. Die Bindung von HRP-3G1 und HRP-5G5 an p166W01-Antigen wurde ebenfalls fast vollständig selbst gehemmt (81 und 80% Hemmung). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass 3G1 und 5G5 das gleiche Epitop oder überlappendes Epitop teilen können, aber 2B1 erkennt wahrscheinlich ein anderes Epitop.

Hemmung der Bindung von mAbs an p166Chn

Die Ergebnisse der Hemmung sind in Tabelle 5 gezeigt: Die Bindung von HRP-4C5 an p166Chn wurde durch unkonjugiertes 4C5 mit 69% Hemmung gehemmt, es gab keine signifikante Hemmung (25 und 30%), die von den anderen 2 unkonjugierten mAbs 3G1 und 4C5 erhalten wurde. Eine höhere Inhibitionsrate wurde jedoch durch HRP-konjugierte mAbs 3G1 und 5G5 erhalten, die an Antigen binden und durch unkonjugiertes 5G5 und 3G1 mit 65 und 76% Inhibition inhibiert wurden. Die Bindung von HRP-konjugiertem 3G1 und HRP-konjugiertem 5G5 an p166Chn-Antigen wurde ebenfalls fast von selbst gehemmt. Diese Ergebnisse deuten auch darauf hin, dass 3G1 und 5G5 dasselbe Epitop oder überlappendes Epitop teilen können, während 4C5 wahrscheinlich ein anderes Epitop erkennt.

Diskussion

Seit der ersten Isolierung des neuartigen Schweine-HEV wurden bei vielen Tieren Anti-HEV-Antikörper gemeldet, die eine HEV-Infektion bei Tieren und Menschen zeigten und von Tieren auf Menschen übertragen werden können . Die Verringerung der Morbidität und Mortalität von Hepatitis E hing von der Impfprävention und einer wirksamen Diagnose ab. Die Kenntnis der Epitope von HEV war für die Impfstoffvorbereitung und die diagnostische Entwicklung unerlässlich . Der Nachweis spezifischer Antikörper im Serum ist eine der wichtigsten diagnostischen Methoden, und es gibt eine wachsende Anzahl serologischer Assays zum Nachweis von Antikörpern. Die zum Nachweis spezifischer Antikörper verwendeten Assays variieren jedoch erheblich in der Empfindlichkeit . Einige kommerzielle diagnostische Assays, die auf Antigenen des Genotyps 1 oder 2 basieren, können Serumantikörper gegen Isolate des Genotyps 3 oder 4 nicht nachweisen . Über die Mechanismen, die der Nichtkorrespondenz der verschiedenen diagnostischen Assays zugrunde liegen, ist wenig bekannt.

Derzeit ist ein in vitro Zellkultursystem für die HEV-Forschung noch nicht verfügbar. Daher wurde pORF2, das die meisten immunogenen Stellen enthält, häufig für HEV-immunologische Studien mit einem konformationsabhängigen Charakter verwendet . Die strukturelle Basis eines Immunogens zur Erzeugung neutralisierender und schützender Antikörper ist das neutralisierende Epitop, das das Hauptziel der Hepatitis-E-Impfstoffentwicklung darstellt . Wir haben zuvor berichtet, dass das p166-Protein, ein verkürztes Protein von pORF2, HEV-neutralisierende Epitope modellieren kann, und Antikörper, die gegen p166 angehoben wurden, könnten verschiedene Genotypen von HEV kreuzneutralisieren . Darüber hinaus war der aus HEV vom Genotyp 1 stammende Hepatitis-E-p239-Impfstoff in einer klinischen Phase-3-Studie in der chinesischen Provinz Jiangsu wirksam, in der das epidemische HEV-Isolat Genotyp 4 ist . Diese Ergebnisse zeigten, dass gemeinsame neutralisierende Epitope innerhalb der verschiedenen Genotypen von HEV existieren. Neben den üblichen neutralisierenden Epitopen wurde auch die Existenz genotypspezifischer Epitope für die mAb-Präparation und -Charakterisierung bestätigt.

Um die Charakterisierung von gemeinsamen und genotypspezifischen neutralisierenden Epitopen weiter zu identifizieren, wurde der kompetitive Inhibitionstest mit gemeinsamen neutralisierenden mAbs, 3G1 und 5G5, und genotypspezifischen neutralisierenden mAbs, 2B1 und 4C5, etabliert, um die Konkurrenzbindung an p166W01 oder p166Chn Antigen zu untersuchen und zu bestimmen, ob die mAbs unabhängige, ähnliche oder überlappende Epitope erkennen.

Anfänglich wurden Aszitesflüssigkeiten der mAbs 3G1, 2B1, 5G5 und 4C5 hergestellt, gereinigt und mit HRP konjugiert. Die ELISA-Methode wurde angewendet, um die Bindungsaffinität von HRP-konjugierten mAbs mit verschiedenen Genotypen von HEV p166 zu vergleichen. Die Ergebnisse zeigten, dass HRP-Konjugat ed 2B1 nur mit dem Genotyp 1 p166W01 reagierte, nicht jedoch mit p166Chn. In ähnlicher Weise reagierte HRP-konjugiertes 4C5 nur mit p166Chn. Im Gegensatz dazu reagierten HRP-konjugiertes 3G1 und 5G5 gut gegen die 2-Genotyp-p166-Proteine. Kompetitive Bindungsassays basieren also auf den HEV-p166-Antigenen vom Genotyp 1 und 4. Die Ergebnisse kompetitiver Bindungsassays sind nicht überraschend, d.h. dass die Bindung von 2B1 an p166W01 nur von selbst konkurrierte, während 3G1 und 5G5 sich gegenseitig um die Bindung an p166W01 konkurrieren konnten. Darüber hinaus wurde die Bindung von 4C5 an p166Chn ebenfalls nur für sich selbst konkurriert, aber 3G1 und 5G5 konnten sich gegenseitig um die Bindung an p166Chn konkurrieren. Diese Ergebnisse zeigten, dass 3G1 und 5G5 die gleichen oder überlappenden Epitope erkennen und dass 2B1 und 4C5 unterschiedliche Epitope erkennen.

Dies ist die erste Studie, die die verschiedenen Eigenschaften von Genotyp-gemeinsamen und Genotyp-spezifischen konformationsneutralisierenden Epitopen von HEV untersucht. Wir haben gezeigt, dass gemeinsame und genotypspezifische neutralisierende Epitope unabhängig sein können. Diese Entdeckung ist sehr nützlich, um die Mechanismen aufzuzeigen, die der geringen Konkordanz der verschiedenen diagnostischen Assays zugrunde liegen. Weitere Studien sind von entscheidender Bedeutung, um die unterschiedlichen Eigenschaften neutralisierender Epitope von HEV für die Wirksamkeit der diagnostischen Entwicklung und Impfstoffzubereitung aufzuklären.

Acknowledgment

Diese Arbeit wurde von der doctoral Scientific Research Foundation der Anhui Medical University (Nr. 0110037101) unterstützt.

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