Galle-Esculin-Test zur vermuteten Identifizierung von Enterokokken und Streptokokken: Auswirkungen der Gallenkonzentration, Impfmethode und Inkubationszeit

Erkennung und Differenzierung von Katalase-negativen, alpha-hämolytischen und nicht-hämolytischen grampositiven Kokken in Paaren und Ketten als Enterokokken; Streptokokken der Gruppe D (mainlyStreptococcus bovis); und Streptokokken der Nicht-Gruppe D der Viridans-Gruppe sind klinisch wichtig (10). Der Galle-Esculin-Test wird häufig verwendet, um Enterokokken und Streptokokken der Gruppe D, die gallentolerant sind und Esculin zu Esculetin hydrolysieren können, von Streptokokken der Nicht-Gruppe D der Viridans-Gruppe zu unterscheiden, die schlecht auf Galle wachsen. Der erstmals 1926 von Meyer und Schonfeld (8) beschriebene Galle-Esculin-Test zeigte nach Facklam und Moody (2, 3, 5) eine Sensitivität von 100% und eine Spezifität von 97% zur Identifizierung von Enterokokken und Streptokokken der Gruppe D. Diese Ergebnisse wurden mit Agarschrägen erhalten, die 4% Oxgall (Gallensalze) enthielten, mit 1 oder 2 Tropfen einer 24-h-Todd-Hewitt-Zellkultur des Organismus („Next-Day“ -Inokulation) inokuliert und für 48 h inkubiert. In der routinemäßigen diagnostischen Bakteriologie ist ein solches Protokoll unpraktisch, da es 3 Tage ab dem Zeitpunkt des Nachweises von Kolonien auf Primärplatten erfordert. Die meisten Lehrbücher und Verfahrenshandbücher empfehlen die Impfung von Agarschrägen direkt aus einigen Kolonien („Impfung am selben Tag“) und nicht aus einer 24-Stunden-Subkultur in Brühe, aber Daten, die diese nicht standardisierte alternative Technik unterstützen, fehlen.

Daher bewerteten wir die Sensitivität und Spezifität des Galle-Esculin-Tests mit zwei verschiedenen Methoden der Impfung am selben Tag (standardisiert und nicht standardisiert) und zwei verschiedenen Inkubationszeiten (24 und 48 h). Wir verglichen auch Esculin Slants mit 2 und 4% Oxgall in Formulierungen, die derzeit von zwei großen kommerziellen Quellen in den Vereinigten Staaten erhältlich sind.

Katalase-negative, grampositive Kokken in Paaren und Ketten, die alpha-hämolytische oder nicht-hämolytische Kolonien auf 5% Schafsblutagar bilden, die positiv für PYR waren (Murex, Dartford, Vereinigtes Königreich) und in tryptischer Sojabrühe mit 6,5% NaCl wuchsen (Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, Md.) wurden als Enterokokken identifiziert; Sie wurden mit dem API Rapid Strep System (bioMérieux Vitek, Hazelwood, Mo.). Katalase-negative, grampositive Kokken in Paaren und Ketten, die alpha-hämolytische oder nicht-hämolytische Kolonien bilden, die für PYR negativ waren, nicht in 6,5% NaCl wuchsen, durch Latexagglutination (Murex) positiv für Gruppe-D-Antigen waren und ein suggestives biochemisches Muster (≥90% Wahrscheinlichkeit) aufwiesen durch das API Rapid Strep System wurden als S. bovis identifiziert. Katalase-negative, grampositive Kokken in Paaren und Ketten, die alpha-hämolytische oder nicht-hämolytische Kolonien bilden, die für PYR- und Gruppe-D-Antigen negativ waren (und in Galle unlöslich waren, wenn alpha-hämolytisch), wurden Streptokokken der Viridans-Gruppe genannt.

Insgesamt wurden 110 Enterokokkenstämme (34 Enterococcus faecalis, 15 Enterococcus faecium und 61 nicht hämolytische und unspezifische Stämme), 30 S. bovis-Stämme (2 alpha-hämolytische und 28 nicht hämolytische Stämme) und 110 Streptokokkenstämme der Nicht-Gruppe-D-Viridans-Gruppe (83 alpha-hämolytische und 27 nicht hämolytische Stämme) getestet. Die Stämme wurden nacheinander aus Blutkulturen isoliert, die während eines Zeitraums von 4 Jahren am Duke University Medical Center durchgeführt wurden, mit Ausnahme von 19 S. b. Überspannungen, die von der Mayo Clinic erhalten wurden.

Frische (24-h) Bakterien wurden auf drei verschiedenen Esculin-Agar-Schrägen inokuliert, die entweder keine Galle (BDMS), 2% Oxgall (entspricht 20% Galle) (BDMS) oder 4% Oxgall (entspricht 40% Galle) enthielten (Remel, Lenexa, Kans.). Mit Ausnahme von Oxgall waren die Zusammensetzungen der drei Medien gleich. Für jedes Medium wurden die folgenden zwei Inokulationstechniken verwendet: (i) direkte, nicht standardisierte S-förmige Inokulation von 1 bis 10 Kolonien und (ii) indirekte, standardisierte Inokulation von 10 µl (kalibrierte Schleife) einer 0,5 McFarland-Standardsuspension von Bakterien in sterilem entionisiertem Wasser. Die Schrägen wurden bei 35 ° C in Umgebungsluft (2) mit losen Kappen für 48 h inkubiert. Die Messwerte wurden bei 24 und 48 h gemessen. Eine Reaktion wurde als positiv angesehen, wenn die Hälfte oder mehr des Mediums geschwärzt war (4).

Mit einer Ausnahme zeigten alle 110 Enterokokkenstämme nach 24 und 48 h Inkubation eindeutig positive Reaktionen (99% Empfindlichkeit). Das standardisierte Inokulum (ungefähr 106 KBE) war genauso empfindlich wie das schwerere, nicht standardisierte Inokulum. Facklam und Moody, die ein Inokulum von 107 bis 108 KBE auf Agarschrägen verwendeten, berichteten über eine Empfindlichkeit von 100% bei 48 h, fanden jedoch 2 von 76 (5) und 6 von 157 (3) Enterokokkenstämmen Galle-Esculin negativ (98% Empfindlichkeit) nach 24 h Inkubation. Swan (13) erhielt unter Verwendung eines nicht standardisierten Inokulums, das als schwer beschrieben wurde, sowie von Agarplatten, auf denen eine Schwärzung als positives Ergebnis angesehen wurde, eine Empfindlichkeit von 100% bei 24 h mit 121 Enterokokkenstämmen. Basierend auf Facklams Veröffentlichungen empfehlen die meisten Lehrbücher und Verfahrenshandbücher jedoch eine Inkubation von 48 Stunden, bevor ein negatives Ergebnis gemeldet wird.

Alle 30 Stämme von S. bovis waren nach 24 und 48 h unabhängig von der Gallenkonzentration oder der Impfmethode positiv (100% Empfindlichkeit). Facklam (3) berichtete über eine Empfindlichkeit von 94 und 100% bei 24 bzw. 48 h mit 37 Streptokokkenstämmen der Gruppe D.

Tabelle 1 gibt die Prozentsätze falsch positiver Galle-Esculin-Tests für 110 Streptokokkenstämme der Nicht-Gruppe D der Viridans-Gruppe an. Wir fanden heraus, dass die Spezifität (100% abzüglich des prozentualen Falsch-positiven) maximal war (97%) mit einem standardisierten Inokulum, das auf Agarschrägen mit 4% Oxgall gestreift und nach 24 h abgelesen wurde. diacetylactisstränge. Mangelnde Standardisierung des Inokulums, Abnahme der Oxgall-Konzentration auf 2% und Verlängerung der Inkubationszeit auf 48 h erhöhten die Anzahl der falsch positiven Ergebnisse auf maximal 24%. In früheren Studien mit einem selektiven Esculin-Agar, der Natriumazid und nur 10% Galle enthielt, waren positive Reaktionen mit Streptokokken der Gruppe D der Viridans-Gruppe häufig (6, 11, 12). Bisher wurden keine Daten zur Verwendung eines Mediums mit 2% Oxgall veröffentlicht. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass diese Konzentration suboptimal ist. Unter Verwendung von 4% Oxgall fand Swan (13) aus 21 Isolaten zwei gallentolerante Streptokokkenstämme der Viridans-Gruppe; Keiner der beiden Stämme hydrolysierte jedoch Esculin bei 24 h. Facklam et al. berichtete Spezifitäten von 99% bei 24 h (3) und 81 (4) bis 97% (3) bei 48 h mit 4% Oxgall.

Ein auffälliger Unterschied wurde festgestellt, als die Untergruppen der alpha-hämolytischen und nicht-hämolytischen Streptokokken der Nicht-Gruppe D der Viridans-Gruppe hinsichtlich der Anzahl der falsch positiven Ergebnisse verglichen wurden. Für alpha-hämolytische Stämme betrug diese Zahl 0% nach 24 h und 3% nach 48 h, während sie für nicht-hämolytische Stämme 11% nach 24 h und 33% nach 48 h betrug, mit 4% Oxgall und einem standardisierten Inokulum (P = 0,017 für 24-h-Werte; two-tailed Fisher’s exact Test). Eine solche Beobachtung wurde bisher nicht gemeldet.

Für andere Proben als Blut und normalerweise sterile Stellen ist ein Flussdiagramm auf der Grundlage des Galle-Esculin-Tests in Kombination mit einer 6,5% igen NaCl-Toleranz oder dem Vorhandensein von PYR ausreichend, um Enterokokken zuverlässig zu identifizieren. Galle-Esculin-positive Organismen aus Blut und normalerweise sterilen Stellen sollten spezifiziert werden. Die Speziation von Enterokokken ist aus epidemiologischen Gründen nützlich und weil E. faecium und andere Arten tendenziell resistenter gegen Antibiotika sind als E. faecalis (8, 9). Eine definitive Identifizierung von Ihnen. bovis ist wichtig, da der Organismus mit Kolonkarzinomen assoziiert ist, die bei solchen Patienten ausgeschlossen werden sollten (7). Auf der anderen Seite, falsch-positive Berichte ofS. bovis kann zu unnötigen Untersuchungen führen. Die Speziation von Galle-Esculin-positiven Organismen ermöglicht auch den Nachweis falsch positiver Streptokokken der Nicht-Gruppe D der Viridans-Gruppe. Therapiefehler können bei der Fehlidentifikation von Streptokokken und Enterokokken auftreten (1). Eine routinemäßige Speziation von Galle-Esculin-negativen Organismen ist nicht erforderlich, da Enterokokken und Streptokokken der Gruppe D selten falsch negative Reaktionen hervorrufen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der Galle-Esculin-Test Enterokokken und Streptokokken der Gruppe D schnell und kostengünstig von Streptokokken der Nicht-Gruppe D der Viridans-Gruppe trennt mit guter Empfindlichkeit (> 99%) und Spezifität (97%), vorausgesetzt, er wird an Agarschrägen durchgeführt, die 40% Galle enthalten, mit einem standardisierten Inokulum (10 µl einer 0,5 McFarland-Standardbakteriensuspension) durchgeführt und bei 24 h.