Genetische Kreuze

Eine genetische Kreuzung ist die gezielte Paarung zweier Individuen, die zur Kombination von genetischem Material in den Nachkommen führt. Kreuze können in vielen Modellsystemen durchgeführt werden — einschließlich Pflanzen, Hefen, Fliegen und Mäusen – und können verwendet werden, um genetische Prozesse zu sezieren oder Organismen mit neuartigen Merkmalen zu erzeugen.

Dieses Video behandelt einige der Prinzipien genetischer Kreuze, untersucht eine Methode zur Durchführung von Kreuzen, die als Tetradenanalyse bekannt ist, und diskutiert verschiedene Anwendungen dieser Technik.

Lassen Sie uns zunächst die Grundprinzipien der Vererbung vorstellen, die genetische Kreuzungen ermöglichen.

Der Phänotyp oder die Zusammensetzung der Merkmale eines Organismus wird durch sein Erbgut oder seinen Genotyp beeinflusst. In den meisten sexuell reproduzierenden Organismen produziert die elterliche Generation haploide Gametenzellen, die eine Kopie jedes einzelnen Chromosoms haben. Diese verschmelzen dann während der Paarung zu einem diploiden Nachkommen mit zwei homologen Kopien jedes Chromosoms. Wenn beide Chromosomen enthalten das gleiche Allel, oder Variante Form eines Gens, dann ist der Organismus „homozygot“ an diesem genetischen Locus; andernfalls, es ist „heterozygot.“

Um den Zyklus neu zu beginnen, erzeugt der diploide Organismus über die Meiose wieder haploide Gameten. Während dieses Prozesses durchlaufen die beiden homologen Chromosomen eine „Rekombination“, bei der Bits äquivalenter Sequenzen zwischen dem Paar ausgetauscht werden. Dieser Prozess mischt die elterlichen Allele auf, die von jedem Nachkommen geerbt werden, wodurch ihre genetische Vielfalt erhöht wird.

Einer der ersten, der systematische genetische Kreuzungen durchführte, war der „Vater der Genetik“ Gregor Mendel. Durch die Verwendung der leicht manipulierbaren Erbsenpflanze und die Untersuchung einer Reihe von Merkmalen mit konsistenten Vererbungsmustern konnte Mendel drei grundlegende Vererbungsgesetze ableiten, die die Grundlage der Genetik bilden würden.

Mendels erstes Gesetz ist das Uniformitätsgesetz, das besagt, dass die heterozygoten Nachkommen der ersten oder F1-Generation von zwei homozygoten Individuen den Phänotyp nur eines Elternteils haben. Das Allel, das diesen Phänotyp etabliert, wird als „dominant“ bezeichnet,Während das „versteckte“ Allel „rezessiv“ ist.“ Wir wissen jetzt, dass Dominanzbeziehungen oft weniger eindeutig sind, mit Fällen wie unvollständiger Dominanz, wo Heterozygoten einen gemischten Phänotyp ausdrücken; und Codominanz, wo beide Phänotypen angezeigt werden.

Das Gesetz der Segregation besagt, dass jedem Gameten zufällig ein Allel zugewiesen wird. Durch Beobachtung, dass die F2-Nachkommen aus der Selbstbefruchtung heterozygoter F1-Individuen a zeigten 3:1 phänotypisches Verhältnis, aber dass zwei der phänotypisch dominanten Individuen tatsächlich heterozygoten sind, folgerte Mendel, dass die beiden elterlichen Allele getrennt vererbt werden müssen. Heute wissen wir, dass Segregation während der Meiose auftritt, wenn die beiden homologen Chromosomen des diploiden Elternteils zufällig in haploide Tochterzellen unterteilt werden, die jeweils eines der beiden Allele erben.

Mendels drittes Gesetz ist das Gesetz des unabhängigen Sortiments, das besagt, dass einzelne Merkmale unabhängig voneinander vererbt werden. Wir wissen jetzt, dass absolute Unabhängigkeit nur für Merkmale besteht, die von Genen auf separaten Chromosomen im haploiden Satz gesteuert werden, die während der Meiose unabhängig auf Tochterzellen verteilt werden. Für zwei Gene auf demselben Chromosom ist der Abstand zwischen ihnen umgekehrt proportional zu der Wahrscheinlichkeit, dass sie auf verschiedene homologe Chromosomen rekombiniert werden, und durch Erweiterung, wie wahrscheinlich sie zusammen in denselben Nachkommen vererbt werden. Daher bietet die Analyse der vier meiotischen Produkte eines diploiden Organismus Wissenschaftlern die Möglichkeit, die Position von Genen abzubilden.

Nachdem wir die Prinzipien hinter genetischen Kreuzen überprüft haben, werfen wir einen Blick auf ein Protokoll für die Tetradenanalyse.

Diese Technik wird typischerweise auf bestimmte einzellige Algen oder Pilze wie Hefen angewendet, um die vier haploiden meiotischen Produkte oder Sporen zu sezieren, die bei diesen Arten als „Tetrade“ in einem einzelnen Zellkörper zusammenbleiben.

Um eine Tetradenanalyse in Hefe durchzuführen, werden die gewünschten Stämme zunächst auf geeigneten Medien gezüchtet. Hefezellen aus einzelnen Kolonien dürfen sich paaren, beispielsweise indem jeder Stamm in einem Kreuzmuster auf einer neuen Platte gestreift wird. Diese Platte wird dann auf selektive Medien plattiert, um nur das diploide Produkt des Kreuzes zu isolieren.

Ausgewählte diploide Zellen werden auf nährstoffarmen Medien gezüchtet, um Sporulation und Tetradenbildung zu induzieren. Die Asci, die die Strukturen sind, die die Tetraden von Sporen halten, werden in Lösungen verdaut, die das Enzym Zymolyase enthalten. Nach dem Aufschluss werden einzelne Asci mit einem Tetradendissektionsmikroskop manipuliert. Sie werden an bestimmten Stellen auf einer Wachstumsplatte angeordnet und unterbrochen, um die einzelnen Sporen freizusetzen. Diese können in einem gitterartigen Muster platziert werden, wobei jede Spore eine einzelne Kolonie erzeugen würde, die weiter analysiert werden kann.

Nachdem Sie nun wissen, wie die Tetradenanalyse durchgeführt wird, wollen wir einige der vielen Anwendungen oder Modifikationen dieser Technik untersuchen.

Die manuelle Präparation von Tetraden ist zeitaufwändig, und Forscher haben Alternativen mit hohem Durchsatz entwickelt, wie z. B. die Barcode-fähige Sequenzierung von Tetraden. Bei dieser Methode wurde die diploide Nachkommenschaft eines Hefekreuzes mit einer Bibliothek von Plasmiden transformiert, von denen jedes eine kurze, eindeutige Sequenz enthält, die als „Barcode“ bekannt ist und als Kennung für jede Nachkommenschaft dient. Die Plasmide exprimieren auch GFP, so dass Hefe-Asci über Durchflusszytometrie selektiert und auf Agarplatten sortiert werden können. Die Asci wurden massenhaft auf den Platten lysiert, und die Sporen durften zu kleinen Kolonien heranwachsen. Die Kolonien wurden dann zufällig zur Genotypisierung auf 96-Well-Platten verteilt. Der einzigartige Sequenz-Barcode ermöglicht es den Forschern, die vier Kolonien zu gruppieren, die aus Sporen jeder Tetrade entstanden sind.

Genetische Kreuze können auch verwendet werden, um Hefezellen mit einer großen Anzahl von Gen-Deletionen zu erzeugen. Im Green Monster-Prozess werden haploide mutierte Hefen, die verschiedene, durch GFP markierte Gen-Deletionen tragen, gepaart und sporuliert. Diese haploiden Nachkommen, von denen einige von beiden Eltern geerbte Deletionen tragen, werden über fluoreszenzaktivierte Durchflusszytometrie sortiert, wobei gezeigt wurde, dass die GFP-Intensität mit der Anzahl der in einem bestimmten Hefestamm vorhandenen Deletionen korreliert. Diese ausgewählten Zellen wurden dann kultiviert und erneut gekreuzt. Die Wiederholung dieses Zyklus erzeugte Hefestämme, die zahlreiche Deletionen enthielten.

Schließlich wurden genetische Kreuze für die Verwendung in vielen Modellsystemen angepasst, wie zum Beispiel dem Malaria verursachenden intrazellulären Parasiten Plasmodium. Da sich der Parasit nur in anderen Zellen vermehren kann, müssen alle Kreuzungsschritte bei Mäusen oder Mücken, dem natürlichen Wirt bzw. Vektor des Parasiten, durchgeführt werden. Hier wurden Mäuse im Blutparasitenstadium mit zwei einzigartigen Plasmodiumstämmen infiziert. Die Parasiten wurden dann durch Blutfütterung in Moskitos übertragen, und sobald sie drinnen waren, reiften sie zu Gameten, die sich befruchten würden, um diploide Zygoten zu bilden. Die reifen Sporozoiten wurden dann von der Mücke geerntet und verwendet, um naïve Mäuse zu infizieren, wo die Parasiten zur Isolierung der interessierenden Kreuznachkommenschaft vermehrt wurden.

Du hast gerade Joves Video über genetische Kreuzungen gesehen. In diesem Video haben wir die Prinzipien der Vererbung vorgestellt, wie genetische Kreuzungen in einigen Organismen mit Tetradendissektion analysiert werden können, und einige aktuelle Anwendungen. Wie immer, danke fürs Zuschauen!