Proteinase K
Durch Calcium aktiviert, verdaut das Enzym Proteine bevorzugt nach hydrophoben Aminosäuren (aliphatische, aromatische und andere hydrophobe Aminosäuren). Obwohl Calciumionen die Enzymaktivität nicht beeinflussen, tragen sie zu ihrer Stabilität bei.Proteine werden vollständig verdaut, wenn die Inkubationszeit lang und die Proteasekonzentration hoch genug ist. Nach Entfernung der Calciumionen wird die Stabilität des Enzyms verringert, die proteolytische Aktivität bleibt jedoch erhalten. Proteinase K hat zwei Bindungsstellen für Ca2 +, die sich in der Nähe des aktiven Zentrums befinden, aber nicht direkt am katalytischen Mechanismus beteiligt sind. Die Restaktivität reicht aus, um Proteine zu verdauen, die üblicherweise Nukleinsäurepräparate kontaminieren. Daher wird der Aufschluss mit Proteinase K zur Reinigung von Nukleinsäuren üblicherweise in Gegenwart von EDTA (Hemmung von metallionenabhängigen Enzymen wie Nukleasen) durchgeführt.
Proteinase K ist auch über einen weiten pH-Bereich (4-12) mit einem pH-Optimum von pH 8,0 stabil.Eine Erhöhung der Reaktionstemperatur von 37 ° C auf 50-60 ° C kann die Aktivität mehrfach erhöhen, wie die Zugabe von 0,5–1% Natriumdodecylsulfat (SDS) oder Guanidiniumchlorid (3 M), Guanidiniumthiocyanat (1 M) und Harnstoff (4 M). Die oben genannten Bedingungen erhöhen die Proteinase-K-Aktivität, indem sie ihre Substratspaltungsstellen zugänglicher machen. Temperaturen über 65°C, Trichloressigsäure (TCA) oder die Serinprotease-Inhibitoren AEBSF, PMSF oder DFP hemmen die Aktivität. Proteinase K wird nicht durch Guanidiniumchlorid, Guanidiniumthiocyanat, Harnstoff, Sarkosyl, Triton X-100, Tween 20, SDS, Citrat, Jodessigsäure, EDTA oder durch andere Serinproteaseinhibitoren wie Na-Tosyl-Lys Chlormethylketon (TLCK) und Na-Tosyl-Phe Chlormethylketon (TPCK).
Protease-K-Aktivität in häufig verwendeten Puffern
| Puffer (pH = 8,0, 50 °C, 1,25 µg/ml Protease K, 15 min Inkubation) | Proteinase-K-Aktivität (%) |
|---|---|
| 30 mM Tris*Cl | 100 |
| 30 Tris·Cl; 30 Millimeter EDTA; 5% Zwischen 20; 0,5% Triton X-100; 800 mM GuHCl | 313 |
| 36 mM Tris * Cl; 36 mM EDTA; 5% zwischen 20; 0,36% Triton X-100; 735 mM GuHCl | 301 |
| 10 Millimeter Tris*Cl; 25 Millimeter EDTA; 100 Millimeter NaCl; 0,5% SDS | 128 |
| 10 mM Tris*Cl; 100 mM EDTA; 20 mM NaCl; 1% Sarkosyl | 74 |
| 10 mM Tris* Cl; 50 mM KCl; 1,5 mM MgCl2; 0,45% zwischen 20; 0,5% Triton X-100 | 106 |
| 10 Tris·Cl; 100 Millimeter EDTA; 0.5% SDS | 120 |
| 30 mm Tris·Cl; 10 mm EDTA; 1% SDS | 203 |