Proteinreinigung
Die Wahl eines Ausgangsmaterials ist entscheidend für die Gestaltung eines Reinigungsprozesses. In einer Pflanze oder einem Tier ist ein bestimmtes Protein normalerweise nicht homogen im ganzen Körper verteilt; Verschiedene Organe oder Gewebe haben höhere oder niedrigere Konzentrationen des Proteins. Die Verwendung nur der Gewebe oder Organe mit der höchsten Konzentration verringert die Volumina, die zur Herstellung einer bestimmten Menge an gereinigtem Protein benötigt werden. Wenn das Protein in geringer Häufigkeit vorhanden ist oder wenn es einen hohen Wert hat, können Wissenschaftler rekombinante DNA-Technologie verwenden, um Zellen zu entwickeln, die große Mengen des gewünschten Proteins produzieren (dies wird als Expressionssystem bezeichnet). Durch die rekombinante Expression kann das Protein markiert werden, z. B. durch einen His-Tag oder Strep-Tag, um die Reinigung zu erleichtern, wodurch die Anzahl der erforderlichen Reinigungsschritte verringert wird.
Eine analytische Reinigung nutzt im Allgemeinen drei Eigenschaften, um Proteine zu trennen. Zunächst können Proteine nach ihren isoelektrischen Punkten gereinigt werden, indem sie durch ein pH-abgestuftes Gel oder eine Ionenaustauschersäule geführt werden. Zweitens können Proteine durch Größenausschlusschromatographie oder durch SDS-PAGE-Analyse (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese) nach ihrer Größe oder ihrem Molekulargewicht getrennt werden. Proteine werden oft mit 2D-PAGE gereinigt und dann durch Peptid-Massen-Fingerprinting analysiert, um die Proteinidentität festzustellen. Dies ist sehr nützlich für wissenschaftliche Zwecke und die Nachweisgrenzen für Protein sind heutzutage sehr niedrig und Nanogramm-Mengen an Protein sind ausreichend für ihre Analyse. Drittens können Proteine durch Polarität/ Hydrophobie über Hochleistungsflüssigkeitschromatographie oder Reversed-Phase-Chromatographie getrennt werden.
Üblicherweise enthält ein Proteinreinigungsprotokoll einen oder mehrere chromatographische Schritte. Das grundlegende Verfahren in der Chromatographie besteht darin, die Lösung, die das Protein enthält, durch eine Säule zu fließen, die mit verschiedenen Materialien gefüllt ist. Verschiedene Proteine interagieren unterschiedlich mit dem Säulenmaterial und können somit durch die zum Passieren der Säule erforderliche Zeit oder die zum Eluieren des Proteins aus der Säule erforderlichen Bedingungen getrennt werden. Üblicherweise werden Proteine, die aus der Säule austreten, durch ihre Absorption bei 280 nm nachgewiesen. Es gibt viele verschiedene chromatographische Methoden:
Größenausschlusschromatographiebearbeiten
Chromatographie kann verwendet werden, um Protein in Lösung oder denaturierenden Bedingungen unter Verwendung von porösen Gelen zu trennen. Diese Technik wird als Größenausschlusschromatographie bezeichnet. Das Prinzip ist, dass kleinere Moleküle ein größeres Volumen in einer porösen Matrix durchqueren müssen. Folglich benötigen Proteine eines bestimmten Größenbereichs ein variables Volumen an Elutionsmittel (Lösungsmittel), bevor sie am anderen Ende der Gelsäule gesammelt werden.
Im Rahmen der Proteinreinigung wird das Eluent üblicherweise in verschiedenen Reagenzgläsern gebündelt. Alle Reagenzgläser, die keine messbare Spur des zu reinigenden Proteins enthalten, werden verworfen. Die verbleibende Lösung wird somit aus dem zu reinigenden Protein und allen anderen ähnlich großen Proteinen hergestellt.
Trennung basierend auf Ladung oder Hydrophobizitätbearbeiten
Hydrophobe Interaktionschromatographiebearbeiten
HIC-Medien sind amphiphil, mit sowohl hydrophoben als auch hydrophilen Regionen, was eine Trennung von Proteinen basierend auf ihrer Oberflächenhydrophobie ermöglicht. Zielproteine und ihre Produktaggregatspezies neigen dazu, unterschiedliche hydrophobe Eigenschaften zu haben, und ihre Entfernung über HIC reinigt das interessierende Protein weiter. Zusätzlich verwendet die verwendete Umwelt gewöhnlich weniger raue Denaturierungsbedingungen als andere Chromatographietechniken und hilft so, das Protein von Interesse in seinem gebürtigen und Funktionszustand zu konservieren. In reinem Wasser wären die Wechselwirkungen zwischen dem Harz und den hydrophoben Bereichen des Proteins sehr schwach, aber diese Wechselwirkung wird durch Aufbringen einer Proteinprobe auf HIC-Harz in Puffer mit hoher Ionenstärke verstärkt. Die Ionenstärke des Puffers wird dann reduziert, um Proteine in der Reihenfolge abnehmender Hydrophobie zu eluieren.
Ionenaustauschchromatographiebearbeiten
Die Ionenaustauschchromatographie trennt Verbindungen nach Art und Grad ihrer Ionenladung. Die zu verwendende Säule wird entsprechend ihrer Art und Stärke der Ladung ausgewählt. Anionenaustauscherharze haben eine positive Ladung und werden verwendet, um negativ geladene Verbindungen (Anionen) zurückzuhalten und abzutrennen, während Kationenaustauscherharze eine negative Ladung haben und zur Abtrennung positiv geladener Moleküle (Kationen) verwendet werden.
Bevor die Trennung beginnt, wird ein Puffer durch die Säule gepumpt, um die entgegengesetzten geladenen Ionen auszugleichen. Bei der Injektion der Probe tauschen sich gelöste Moleküle mit den Pufferionen aus, da jede um die Bindungsstellen auf dem Harz konkurriert. Die Länge der Retention für jeden gelösten Stoff hängt von der Stärke seiner Ladung ab. Die am schwächsten geladenen Verbindungen eluieren zuerst, gefolgt von solchen mit sukzessive stärkeren Ladungen. Aufgrund der Art des Trennmechanismus spielen pH-Wert, Puffertyp, Pufferkonzentration und Temperatur eine wichtige Rolle bei der Steuerung der Trennung.
Die Ionenaustauschchromatographie ist ein sehr leistungsfähiges Werkzeug für die Proteinreinigung und wird häufig sowohl in analytischen als auch in präparativen Trennungen eingesetzt.
Free-Flow-elektrophoresebearbeiten
Die Freiflusselektrophorese (FFE) ist eine trägerfreie Elektrophoresetechnik, die eine präparative Proteintrennung in einem laminaren Pufferstrom unter Verwendung eines orthogonalen elektrischen Feldes ermöglicht. Durch die Verwendung eines pH-Gradienten, der beispielsweise durch Ampholyte induziert werden kann, ermöglicht diese Technik die Trennung von Proteinisoformen bis zu einer Auflösung von < 0,02 Delta-pI.
Affinitätschromatographiebearbeiten
Die Affinitätschromatographie ist eine Trenntechnik, die auf molekularer Konformation basiert und häufig anwendungsspezifische Harze verwendet. Diese Harze weisen an ihren Oberflächen Liganden auf, die spezifisch für die zu trennenden Verbindungen sind. Am häufigsten funktionieren diese Liganden ähnlich wie Antikörper-Antigen-Interaktionen. Diese „Lock and Key“ -Anpassung zwischen dem Liganden und seiner Zielverbindung macht ihn hochspezifisch und erzeugt häufig einen einzelnen Peak, während alles andere in der Probe nicht bestimmt wird.
Viele Membranproteine sind Glykoproteine und können durch Lektinaffinitätschromatographie gereinigt werden. Detergens-solubilisierte Proteine können an ein Chromatographieharz binden, das modifiziert wurde, um ein kovalent gebundenes Lektin zu haben. Proteine, die nicht an das Lektin binden, werden weggewaschen und dann können spezifisch gebundene Glykoproteine durch Zugabe einer hohen Konzentration eines Zuckers eluiert werden, der mit den gebundenen Glykoproteinen an der Lektin-Bindungsstelle konkurriert. Einige Lektine haben eine hohe Affinitätsbindung an Oligosaccharide von Glykoproteinen, die schwer mit Zuckern zu konkurrieren ist, und gebundene Glykoproteine müssen durch Denaturierung des Lektins freigesetzt werden.
Immunaffinitätschromatographiebearbeiten
Die Immunaffinitätschromatographie nutzt die spezifische Bindung eines Antikörper-Antigens, um das Zielprotein selektiv zu reinigen. Das Verfahren beinhaltet die Immobilisierung eines Proteins an ein festes Substrat (z. B. eine poröse Perle oder eine Membran), die dann selektiv das Ziel bindet, während alles andere durchfließt. Das Zielprotein kann durch Veränderung des pH-Wertes oder der Salinität eluiert werden. Der immobilisierte Ligand kann ein Antikörper (wie Immunglobulin G) oder ein Protein (wie Protein A) sein. Da diese Methode kein Engineering in einem Tag beinhaltet, kann sie für Proteine aus natürlichen Quellen verwendet werden.
Reinigung eines markierten Proteinsbearbeiten
Eine andere Möglichkeit, Proteine zu markieren, besteht darin, ein Antigen-Peptid-Tag auf das Protein zu konstruieren und das Protein dann auf einer Säule oder durch Inkubation mit einem losen Harz, das mit einem immobilisierten Antikörper beschichtet ist, zu reinigen. Dieses spezielle Verfahren wird als Immunpräzipitation bezeichnet. Die Immunpräzipitation ist durchaus in der Lage, eine äußerst spezifische Wechselwirkung zu erzeugen, die normalerweise dazu führt, dass nur das gewünschte Protein gebunden wird. Die gereinigten markierten Proteine können dann leicht von den anderen Proteinen in Lösung getrennt und später wieder in saubere Lösung eluiert werden.
Wenn die Tags nicht mehr benötigt werden, können sie durch eine Protease abgespalten werden. Dies beinhaltet oft die Entwicklung einer Protease-Schnittstelle zwischen dem Tag und dem Protein.
HPLCEdit
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie oder Hochdruckflüssigkeitschromatographie ist eine Form der Chromatographie, die Hochdruck anwendet, um die gelösten Stoffe schneller durch die Säule zu treiben. Dies bedeutet, dass die Diffusion begrenzt und die Auflösung verbessert wird. Die gebräuchlichste Form ist die „Reversed Phase“ HPLC, bei der das Säulenmaterial hydrophob ist. Die Proteine werden durch einen Gradienten zunehmender Mengen eines organischen Lösungsmittels, wie Acetonitril, eluiert. Die Proteine eluieren entsprechend ihrer Hydrophobie. Nach der Reinigung durch HPLC liegt das Protein in einer Lösung vor, die nur flüchtige Verbindungen enthält und leicht lyophilisiert werden kann. Die HPLC-Reinigung führt häufig zu einer Denaturierung der gereinigten Proteine und ist daher nicht auf Proteine anwendbar, die sich nicht spontan wiederfalten.