RecA
RecA ist ein 38-Kilodalton-Protein, das für die Reparatur und Wartung von DNA essentiell ist. Ein RECA strukturelles und funktionelles Homolog wurde in jeder Spezies gefunden, in der man ernsthaft gesucht wurde und dient als Archetyp für diese Klasse von homologen DNA-Reparaturproteinen. Das homologe Protein heißt RAD51 in Eukaryoten und RadA in Archaeen.
| recA bakterielles DNA-Rekombinationsprotein | ||||||
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Kristallstruktur eines RecA-DNA-Komplexes. PDB IDENTIFIKATION: 3cmt.
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| Identifiers | ||||||
| Symbol | RecA | |||||
| Pfam | PF00154 | |||||
| Pfam clan | CL0023 | |||||
| InterPro | IPR013765 | |||||
| PROSITE | PDOC00131 | |||||
| SCOP2 | 2reb / SCOPe / SUPFAM | |||||
| Available protein structures: | Pfam | PDB | PDBsum | |||
RecA hat mehrere Aktivitäten, die alle mit der DNA-Reparatur zusammenhängen. In der bakteriellen SOS-Antwort hat es eine Co-Protease-Funktion bei der autokatalytischen Spaltung des LexA-Repressors und des λ-Repressors.
Die Assoziation von RecA mit DNA major beruht auf seiner zentralen Rolle bei der homologen Rekombination. Das RECA-Protein bindet stark und in langen Clustern an ssDNA, um ein Nukleoproteinfilament zu bilden. Das Protein hat mehr als eine DNA-Bindungsstelle und kann somit einen Einzelstrang und einen Doppelstrang zusammenhalten. Dieses Merkmal ermöglicht es, eine DNA-Synapsis-Reaktion zwischen einer DNA-Doppelhelix und einer komplementären Region einzelsträngiger DNA zu katalysieren. Das RECA-ssDNA Filament sucht nach Sequenzähnlichkeit entlang der dsDNA. Eine ungeordnete DNA-Schleife in RecA, Schleife 2, enthält die für die DNA-homologe Rekombination verantwortlichen Reste. Bei einigen Bakterien kann die posttranslationale Modifikation von RecA durch Phosphorylierung eines Serinrestes auf Schleife 2 die homologe Rekombination stören.
Der Suchprozess induziert eine Dehnung des DNA-Duplexes, wodurch die Erkennung der Sequenzkomplementarität verbessert wird (ein Mechanismus, der als Konformations-Korrekturlesen bezeichnet wird). Die Reaktion initiiert den Austausch von Strängen zwischen zwei rekombinierenden DNA-Doppelhelices. Nach dem Synapse-Ereignis beginnt in der Heteroduplex-Region ein Prozess, der als Verzweigungsmigration bezeichnet wird. Bei der Verzweigungsmigration verschiebt ein ungepaarter Bereich eines der Einzelstränge einen gepaarten Bereich des anderen Einzelstrangs, wobei der Verzweigungspunkt verschoben wird, ohne die Gesamtzahl der Basenpaare zu ändern. Eine spontane Verzweigungsmigration kann jedoch auftreten, da sie im Allgemeinen in beide Richtungen gleich verläuft, ist es unwahrscheinlich, dass die Rekombination effizient abgeschlossen wird. Das RECA-Protein katalysiert die unidirektionale Verzweigungsmigration und ermöglicht so die vollständige Rekombination, wodurch eine Region von Heteroduplex-DNA erzeugt wird, die Tausende von Basenpaaren lang ist.
Da es sich um eine DNA-abhängige ATPase handelt, enthält RecA eine zusätzliche Stelle zur Bindung und Hydrolyse von ATP. RecA verbindet sich enger mit DNA, wenn ATP gebunden ist, als wenn ADP gebunden ist.
In Escherichia coli können homologe Rekombinationsereignisse, die durch RecA vermittelt werden, während der Zeit nach der DNA-Replikation auftreten, wenn Schwesterorte nahe bleiben. RecA kann auch Homologiepaarung, homologe Rekombination und DNA-Bruchreparatur zwischen entfernten Schwesterorten vermitteln, die sich zu gegenüberliegenden Hälften der E. coli-Zelle getrennt hatten.
RecA-defiziente E. coli-Stämme eignen sich für Klonierungsverfahren in molekularbiologischen Labors. E. coli-Stämme werden häufig genetisch modifiziert, um ein mutiertes recA-Allel zu enthalten und dadurch die Stabilität extrachromosomaler DNA-Segmente, so genannter Plasmide, zu gewährleisten. In einem Prozess namens Transformation wird Plasmid-DNA von den Bakterien unter verschiedenen Bedingungen aufgenommen. Bakterien, die exogene Plasmide enthalten, werden „Transformanten“ genannt. Transformanten behalten das Plasmid während der gesamten Zellteilung, so dass es zurückgewonnen und in anderen Anwendungen verwendet werden kann. Ohne funktionelles RecA-Protein wird die exogene Plasmid-DNA von den Bakterien unverändert belassen. Die Reinigung dieses Plasmids aus Bakterienkulturen kann dann eine High-Fidelity-PCR-Amplifikation der ursprünglichen Plasmidsequenz ermöglichen.