Tyrosinase
8.14.2.2.4 Tyrosinase (EC 1.14.18.1) und Catecholoxidase (EC 1.10.3.1)
Tyrosinase, die zu einer Proteinfamilie gehört, deren katalytisches Zentrum durch dinukleares Typ-3-Kupfer gebildet wird, katalysiert die Orthohydroxylierung von Monophenol und die anschließende Oxidation des Diphenolprodukts zum resultierenden Chinon.178 Eine Reihe von Reaktionen findet unter gleichzeitiger Reduktion von molekularem Sauerstoff zu Wasser statt. Das Chinonprodukt ist ein reaktiver Vorläufer für die Synthese von Melaninpigmenten. Tyrosinase, die in Gemüse, Obst und Pilzen enthalten ist, ist ein Schlüsselenzym für die Bräunung, die bei Blutergüssen oder Langzeitlagerung auftritt. Bei Säugetieren ist das Enzym für Hautpigmentierungsstörungen wie Flecken und Defekte verantwortlich.179 Somit ist Tyrosinase in den Bereichen Landwirtschaft und Industrie von großer Bedeutung. In der Kosmetikindustrie sind die Entwicklung und das Screening von potenten Inhibitoren der Tyrosinase besonders attraktiv.
Tyrosinase wird ebenso wie Katecholoxidase und das respiratorische Pigment Hämocyanin in die Typ-3-Kupferproteinfamilie eingeteilt. Während der katalytischen Reaktion existiert das Typ-3-Kupferzentrum der Tyrosinase in drei Redoxformen.178 Die Desoxyform (Cu(I)–Cu(I)) ist eine reduzierte Spezies, die Sauerstoff zur Oxyform (Cu(II)–O22-Cu(II)) bindet. In der Oxy-Form wird molekularer Sauerstoff als Peroxid in einem μ-η2: η2-Side-on-Brückenmodus gebunden, der die O–O-Bindung destabilisiert und aktiviert. Die Met-Form (Cu (II) –Cu (II)) wird als ruhende enzymatische Form angenommen, wobei Cu (II) -Ionen normalerweise mit einem kleinen Liganden, wie einem Wassermolekül oder Hydroxidion, verbrückt sind.
Catecholoxidase oxidiert Ortho-Diphenole zu den entsprechenden Chinonen, hat aber keine Monooxygenase- oder Kresolase-Aktivität. Hämocyanin wirkt als Sauerstoffträger in Arthropoden und Mollusken.
Die Kristallstrukturen von Tyrosinase aus Streptomyces castaneoglobisporus HUT 620268 und Catecholoxidase aus der Süßkartoffel Ipomoea batatas180 wurden bestimmt. Sie bestätigen, dass die Koordination der Typ-3-Kupferstelle in Tyrosinase und Katecholoxidase der in Hämocyanin sehr ähnlich ist. Dies war zuvor aus der Ähnlichkeit der spektroskopischen Eigenschaften und einem Vergleich vieler Tyrosinase- und Hämocyanin-Primärstrukturen abgeleitet worden.181-183 Anhand der biologischen Quelle der Proteine konnten sieben verschiedene Domänenorganisationen identifiziert werden. Pflanzliche Katecholoxidasen verschiedener Organismen haben eine Sequenzidentität von etwa 40-60%. Die Sequenzidentität zwischen Catecholoxidasen und Mulluscan-Hämocyanen beträgt etwa 35% über fast die gesamte Länge der Sequenzen. Im Gegensatz dazu ist die Sequenzidentität zwischen pflanzlichen Catecholoxidasen und anderen Typ-3-Kupferproteinen aus nichtpflanzlichen Quellen auf die beiden kupferbindenden Regionen beschränkt.
Die beiden kupferbindenden Regionen zeigen die höchste Konservierung aller Typ-3-Kupferproteine. Besonders die Region, die CuB bindet, ist stark konserviert, während die CuA-bindende Region mehr Sequenzvielfalt zeigt und für die verschiedenen Funktionen von Tyrosinase, Catecholoxidase und Hämocyanin verantwortlich gemacht wurde.
Die Gesamtstruktur der Tyrosinase aus S. castaneoglobisporus im Komplex mit offenem Leserahmen ORF378 ist in Abbildung 23 dargestellt. Tyrosinase nimmt α-helikale Strukturen mit dem Kern des Enzyms auf, das von einem Vierhelixbündel gebildet wird. Das katalytische zweikernige Kupferzentrum befindet sich im Spiralbündel (Abbildung 23). Jedes der beiden Kupferionen in einem aktiven Zentrum wird von drei His-Resten koordiniert (Abbildung 24), die von den vier Helices des α-Bündels außer His54 abgeleitet sind. Ein Kupferion (CUA) wird von His38, His54 und His63 koordiniert. His38 und His63 befinden sich in der Mitte von α2 bzw. α3. Das zweite Kupferion (CuB) wird von His190, His194 und His216 koordiniert. Die Reste His190 und His194 befinden sich am Anfang bzw. in der Mitte von α6 und His216 befindet sich in der Mitte von α7. Dieses Dicopper-Zentrum befindet sich am Boden der großen Konkavität als mutmaßliche Substratbindungstasche, die durch die hydrophoben Rückstände gebildet wird. Zusätzlich zur helikalen Struktur weist Tyrosinase einige β-Strukturen auf, wie aus den Rückgrattorsionswinkeln hervorgeht. In diesen bilden nur die N- und C-terminalen β-Stränge ein Flächengebilde.
Abbildung 23. Farbbanddiagramm der Tyrosinase aus Streptomyces castaneoglobisporus im Komplex mit ORF378 (PDB-Code: 1WX3). Tyrosinase und ORF378 sind in Rosa bzw. Die Kupferionen CuA und CuB sind als gelbe Kugeln dargestellt; hergestellt mit PyMOL (W. L. DeLano, Palo Alto, 2003).
Abbildung 24. Die met-Form des aktiven Zentrums der Tyrosinase aus Streptomyces castaneoglobisporus (PDB-Code: 1WX3); hergestellt mit PyMOL (W. L. DeLano, Palo Alto, 2003).
Obwohl die Aminosäuresequenz der Tyrosinase nur 25,3 und 26,0% Identität mit denen der I. batatas-Catecholoxidase180 bzw. der odg-Domäne des Octopus dofleini-Hämocyanins 184 aufweist, ist ihre Gesamtstruktur ihrer ziemlich ähnlich. Unter diesen drei Proteinen wird ein hoher Grad an Konservierung in der Kerndomäne beobachtet, die aus dem α-Bündel besteht. Die Tyrosinase und Hämocyane aus Panulirus plutus 185 und L. polyphemus66 zeigen keine signifikante Homologie und keine Ähnlichkeit in ihren Strukturen, aber die katalytischen Kerndomänen dieser Proteine sind überlagerbar.
Für Tyrosinase aus S. castaneoglobisporus konnten fünf verschiedene Zustände des aktiven Zentrums in Kristallstrukturen charakterisiert werden, nämlich kupferfreie Form, Met-Form I, Met-Form II, Deoxy und oxy. In Kristallstrukturen der Catecholoxidase aus I. batatas wurden die Met- und Deoxy-Zustände sowie ein Inhibitorkomplex aufgeklärt. Im Met-Zustand (Cu(II), Cu(II)) liegen die beiden Kupferionen im Abstand von 2.9 Å, die jeweils von drei Histidinen koordiniert werden. Sie sind durch ein anderes Atom, höchstwahrscheinlich ein Hydroxidion, in einem Abstand von etwa 1,8 Å von jedem Kupferion überbrückt, so dass jedes von ihnen eine Koordinationszahl von 4 aufweist (siehe Abbildung 24, die die gleiche Situation für Tyrosinase aus S. castaneoglobisporus zeigt). Im Desoxy- oder reduzierten Zustand befinden sich beide Kupferatome in der Oxidationsstufe +1. Der Kupfer-Kupfer-Abstand beträgt 4,4 Å. Die Koordinationszahlen sind 4 für CuA (drei Histidinliganden und ein koordinierendes Wassermolekül) und 3 für CuB (drei Histidinliganden). Die Koordinationssphäre ist verzerrt trigonal pyramidal für CuA und quadratisch planar für CuB (die Koordinationsstelle, die vom überbrückenden OH besetzt ist − im Met-Zustand ist frei). Im Inhibitorkomplex mit Phenylthioharnstoff (PTU) erhöht sich der Kupfer–Kupfer-Abstand auf 4,2 Å, wobei das Schwefelatom von PTU die Hydroxobrücke des Met-Zustands ersetzt. Die Koordinationssphären der beiden Kupfer bleiben denen des Met-Zustands ähnlich, aber es gibt Konformationsänderungen an den aktiven Standortresten. Die bedeutendste Änderung ist eine Rotation des aromatischen Rings von Phe261 (Katecholoxidase-Nummerierung).
Im Vergleich zum Met-Zustand weisen die koordinierenden Rückstände im reduzierten Zustand nur geringfügig unterschiedliche Positionen auf, was auf eine eher starre Tasche hindeutet. Die Koordinationsänderungen sind mit Bewegungen der Kupferatome in der Tasche verbunden. Der Inhibitorkomplex zeigt, dass sich Phe261 wie ein Gate über dem aktiven Zentrum befindet, das sich dreht, nachdem der Inhibitor gebunden ist. Somit scheint der Zugang des Substrats zum katalytischen Metallzentrum durch diesen ‚Gate-Rest‘ gesteuert zu werden.
Der katalytische Mechanismus der Tyrosinase wurde zuerst von Solomon et al.178 Solomon schlug einen Mechanismus sowohl für die Kresolase- als auch für die Katecholase-Aktivität von Tyrosinase vor (Abbildung 25). Dieser Mechanismus legt nahe, dass der Oxy-Zustand der Ausgangspunkt der Kresolase-Aktivität (innerer Kreis) ist. Dieser Zustand liegt in der Ruheform der Tyrosinase in einem Anteil von etwa 15% vor (85% Met-Zustand). Ein Monophenolsubstrat bindet an den Oxy-Zustand und wird zu o-Diphenol monooxygeniert. Dieses Diphenol bindet anschließend in einer anhand einer Modellverbindung vorgeschlagenen zweizähnigen Bindungsart an das Kupferzentrum der Tyrosinase.188 Oxidation des Diphenolsubstrats führt zum reduzierten Zustand des dinuklearen Kupferzentrums. Die Reoxidation des reduzierten Zustands in den Oxyzustand erfolgt durch Angriff von Dioxygen und schließt den katalytischen Kreislauf.
Abbildung 25. Mechanismus der Kresolase- und Katecholase-Aktivität von Tyrosinase und Katecholoxidase entwickelt auf der Grundlage eines ersten Vorschlags von Solomon und Mitarbeitern178 und einschließlich neuerer Ergebnisse.186,187 Nach C. Gerdemann; C. Eicken; B. Krebs, Acc. Chem. Res. 2002, 35, 183-191, mit Genehmigung der American Chemical Society.
Der Mechanismus der Katecholaseaktivität (äußerer Kreis) geht von den Zuständen Oxy und Met aus. Ein Diphenolsubstrat bindet beispielsweise an den Met-Zustand, gefolgt von der Oxidation des Substrats zum ersten Chinon und der Bildung des reduzierten Zustands des Enzyms. Die Bindung von Dioxygen führt zum Oxy-Zustand, der anschließend vom zweiten Diphenolmolekül angegriffen wird. Die Oxidation zum zweiten Chinon bildet wieder den Met-Zustand und schließt den katalytischen Kreislauf.
Alternative Reaktionsmechanismen umfassen einen Radikalmechanismus, der von Kitajima und Morooka189 vorgeschlagen wurde, und einen Mechanismus, der ein Cu (III) -Zwischenprodukt basierend auf Messungen von Modellverbindungen umfasst.190 Aufgrund der Kristallstruktur des Katecholoxidase–PTU-Inhibitorkomplexes wurde eine monodentate Bindung des Substrats für die Katecholoxidase vorgeschlagen.180 Ein radikalischer Mechanismus, wie er für die schwache Katecholaseaktivität in Octopus vulgaris Hämocyanin vorgeschlagen wird,191 ist auch für Katecholoxidase aufgrund der starken strukturellen Beziehung zwischen Katecholoxidase aus I. batatas und odg-Hämocyanin, wie oben beschrieben, möglich.
Der deutliche Unterschied zwischen Katecholoxidase und Tyrosinase ist noch nicht erklärt. Es wurde eine Verzögerungsphase in der Monophenolase-Aktivität von Tyrosinase gefunden und untersucht, und es wird vorgeschlagen, dass sie auf eine vorübergehende Hemmung des Met-Zustands von Tyrosinase durch Überschuss des Monophenolsubstrats zurückzuführen ist (Abbildung 25).186 Die Monophenolase-Aktivität nimmt zu, wenn das Diphenolprodukt das Monophenol aus der Tyrosinase verdrängt und die Fortsetzung des katalytischen Zyklus ermöglicht. Catecholoxidase in ihrer isolierten Form liegt ausschließlich im Met-Zustand vor und wird auch durch Phenol inhibiert. Es wurde daher vorgeschlagen, dass das Fehlen des Oxy-Zustands der Grund dafür ist, dass der Katecholoxidase die Kresolase-Aktivität fehlt. Da auch die Oxy-Catecholoxidase keine Monooxygenase-Aktivität zeigt, erscheint diese Erklärung nicht ganz befriedigend. Ein weiterer möglicher Grund ist, dass der Zugang zu CuA, der für die Oxygenierung von Monophenolen als notwendig vorgeschlagen wurde,192 in der Kristallstruktur der Catecholoxidase aus I. batatas blockiert ist.