Was ist Southern Blotting?

Von Hannah Simmons, M.Sc.Rezensiert von Kate Anderton, B.Sc . (Herausgeber)

Blotting ist der Prozess, bei dem DNA, RNA oder Proteine auf eine Membran übertragen werden, um sichtbar gemacht zu werden.

Kredit: Paul Cowan /.com

Die erste dieser Methoden war das Southern Blotting, das 1975 von Edward Southern entwickelt wurde und zum Nachweis der Sequenz von DNA-Fragmenten verwendet wird. Seitdem wurden zwei weitere Methoden entwickelt, Northern und Western Blotting. Hierbei handelt es sich um Verfahren, mit denen RNA- bzw. Proteinsequenzen identifiziert werden.

Methodik des Southern Blotting

DNA-Fragmente werden zunächst mit Restriktionsenzymen erzeugt und in einem als Gelelektrophorese bezeichneten Verfahren nach Größe getrennt. Alkalisch wird dann verwendet, um die doppelsträngige DNA zu denaturieren und einzelne Stränge zu bilden. Die DNA wird dann auf eine Nitrozellulose- oder Nylonfolie übertragen, indem eine Membran über das Gel gelegt wird und der Pufferfluss verwendet wird, um die Bewegung der DNA vom Gel zur Membran zu fördern.

Kapillarfluss und Vakuumtransfer sind die beiden gebräuchlichsten Methoden zur Übertragung der DNA-Fragmente. Im Kapillarfluss wird das Gel oberhalb des Pufferspiegels auf einen Stützblock mit einer darauf angeordneten Membran gelegt. Ein Stapel saugfähiger Handtücher wird dann über die Membran gelegt und verwendet, um den Puffer unter dem Gel zu absorbieren und die DNA-Fragmente auf die Membran zu heben.

Mittels Vakuumtransfer wird die Membran unter das Gel gelegt und beide in Puffer getaucht. Ein Vakuum wird dann verwendet, um einen Fluss zu erzeugen, der die DNA-Fragmente auf die Membran zieht.

Durch Erhitzen oder UV-Strahlung wird dann sichergestellt, dass die DNA-Fragmente unter Beibehaltung der spezifischen Anordnung der DNA dauerhaft an der Membran haften bleiben. Einzelsträngige markierte Sonden werden dann verwendet, um an Zielsequenzen zu binden.

Das Blatt wird mit diesen Sonden inkubiert und nur die komplementären Sonden binden. Die nicht komplementären Sonden werden dann von der Membran abgewaschen, so dass nur die gebundenen Sonden übrig bleiben. Diese Sonden können dann durch Autoradiographie nachgewiesen werden, um das Muster der Hybridisierung auf einem Röntgenfilm aufzudecken.

Anwendungen von Southern Blotting

Southern Blotting hat viele verschiedene Anwendungen. Zunächst können Genumlagerungen analysiert werden. In der Immunologie kann diese Methode beispielsweise verwendet werden, um die klonalen Umlagerungen von T-Zell-Rezeptorgenen zu identifizieren. Zweitens können spezifische DNA-Fragmente aus einer Mischung vieler anderer Fragmente identifiziert werden.

Andere Anwendungsbeispiele umfassen sowohl Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) als auch VNTR-Analyse (Variable Number Tandem Repeat). RFLP verwendet die Längenunterschiede in homologen DNA-Sequenzen, um Genome abzubilden, und kann in forensischen und Vaterschaftstests verwendet werden.

Die VNTR-Analyse verwendet die Längenunterschiede wiederholter Nukleotidsequenzen, um einen DNA-Fingerabdruck zu bilden, eine Methode, die häufig in Vaterschafts- und forensischen Tests verwendet wird.

Diese Methoden können auch bei der Diagnose von mutationsbedingten Erkrankungen, beispielsweise der Sichelzellenanämie, eingesetzt werden. Diese genetische Erkrankung ist auf einen Einzelnukleotidpolymorphismus (A bis T) im Beta-Globin-Gen zurückzuführen, der zu abnormalem Hämoglobin führt.

Southern Blotting für das Fragile-X-Syndrom

Southern Blots wurden ausgiebig verwendet, um Gene mit amplifizierten Wiederholungsregionen zu identifizieren. Dies sind kurze, sich wiederholende Sequenzen in der DNA, die keine Genprodukte kodieren. Ein Beispiel, in dem Southern Blotting nützlich sein kann, ist die Diagnose des Fragilen X-Syndroms. Dieser genetische Zustand ist auf die Zunahme der CGG / CCG-Wiederholungsregion zurückzuführen, die sich innerhalb des FMR1-Gens befindet.

Dieses Gen enthält normalerweise zwischen 5-40 Wiederholungsregionen. Personen mit 55-200 Wiederholungen haben eine FMR1-Genprämutation, und Personen mit > 200 Wiederholungen haben ein Fragiles X-Syndrom. Die Zunahme der Wiederholungen führt zu einer Methylierung des Gens, die die Transkription hemmt und die Produktion des FMRP-Proteins verhindert. Dieses Protein wird für die normale Funktion des Nervensystems benötigt, daher führt der Verlust der Proteinfunktion zu den Symptomen des Fragilen X-Syndroms.

In der Diagnostik werden das methylierungsempfindliche Restriktionsenzym EclX1 und das methylierungsunempfindliche Enzym EcoR1 verwendet, um die Differenzierung von methylierten Allelen und nicht-methylierten Allelen zu ermöglichen. Methylierte Allele werden nur einmal geschnitten, um ein einzelnes DNA-Fragment von 5,1 kb zu erhalten.

Nicht-methylierte Allele werden jedoch zweimal geschnitten, wodurch ein Fragment von 2,8 kb entsteht. Nicht-methylierte Prämutationswiederholungen (<200) können daher von methylierten Mutationswiederholungen mit einer Länge von etwa 200 Wiederholungen unterschieden werden, da durch Southern-Blotting die Größen der DNA-Fragmente identifiziert werden können.

Zukunftsperspektiven

Insgesamt ist Southern Blotting eine wichtige Methode bei der Diagnose und Untersuchung von Krankheiten (wie Fragile-X-Syndrom und Sichelzellenanämie) und der Analyse von DNA aus anderen Gründen (wie Forensik und Vaterschaftstests).

Das Southern Blotting ist jedoch technisch sehr aufwendig, teuer, aufwendig und erfordert eine große Menge an DNA-Probe. Neue Methoden ersetzen daher langsam das Southern Blotting, zum Beispiel die Real Time PCR. Dieser Prozess ist viel einfacher und schneller als Southern Blotting und erfordert nur ein sehr kleines Volumen an DNA.

Weiterführende Literatur

• Alle Genetikinhalte
• Was ist Genetik?
• Geschichte der Genetik
• Genetik und Genexpression
• Genetische Veränderung

Geschrieben von

Hannah Simmons

Hannah ist eine medizinische und Life Sciences-Autorin mit einem Master of Science (M.Sc .) Abschluss an der Lancaster University, Großbritannien. Bevor sie Schriftstellerin wurde, konzentrierte sich Hannahs Forschung auf die Entdeckung von Biomarkern für Alzheimer und Parkinson. Sie arbeitete auch daran, die biologischen Wege, die an diesen Krankheiten beteiligt sind, weiter aufzuklären. Außerhalb ihrer Arbeit schwimmt Hannah gerne, geht mit ihrem Hund spazieren und bereist die Welt.

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