Ziel

Erlernen der Technik der Latex-Agglutination.

Latex-Agglutination wird beobachtet, wenn eine Probe, die das spezifische Antigen (oder Antikörper) enthält, mit einem Antikörper (oder Antigen) gemischt wird, der auf der Oberfläche von Latexpartikeln beschichtet ist.

Latex-Agglutinationstests wurden in klinischen Labors zum Nachweis von Infektionskrankheiten angewendet und 1956 beschrieben Singer und Plotz erstmals den Rheumafaktor-Test, einen Test auf der Basis von Latex-Agglutination. Bei der rheumatoiden Arthritis (RA) reagieren IgG-Antikörper, die von Lymphozyten im Synovialgelenk produziert werden, mit den IgM-Antikörpern (RF, Rheumafaktor), um Immunkomplexe zu erzeugen, die das Komplement aktivieren und die Gewebezerstörung verursachen. Die RA ist von diagnostischer Bedeutung.

Seitdem wurden Tests zum Nachweis von mikrobiellen und viralen Infektionen, Autoimmunerkrankungen, Hormonen, Medikamenten und Serumproteinen von vielen Unternehmen weltweit entwickelt und vermarktet. Das Prinzip wird für die Diagnose vieler Infektionen wie Hepatitis B, H.influenzae, N. meningitidis usw. verwendet.. Alle Methoden zum Nachweis oder zur Quantifizierung von Antigen oder Antikörpern nutzen die Tatsache aus, dass sie zu einem Komplex reagieren. Bei optimaler Antigen-Antikörper-Konzentration fällt dieser Komplex aus. Wenn das Antigen jedoch partikulärer Natur ist, wird eine Agglutination des Antigen-Antikörper-Komplexes beobachtet.

Agglutinationsreaktionen

Die Reaktion zwischen einem partikulären Antigen und einem Antikörper führt zu einer sichtbaren Verklumpung, die als Agglutination bezeichnet wird. Antikörper, die solche Reaktionen hervorrufen, sind als Agglutinine bekannt. Das Prinzip der Agglutinationsreaktionen ähnelt den Fällungsreaktionen, sie hängen von der Vernetzung mehrwertiger Antigene ab. Wenn das Antigen ein Erythrozyt ist, spricht man von Hämagglutination.Theoretisch können alle Antikörper partikuläre Antigene agglutinieren, aber IgM ist aufgrund seiner hohen Spezifität ein besonders gutes Agglutinin.

Es kann keine Agglutination beobachtet werden, wenn die Antikörperkonzentration hoch ist (niedrigere Verdünnungen), und dann wird die Probe verdünnt, Agglutination tritt auf. Der Prozoneneffekt ist definiert als die Unsichtbarkeit der Agglutination bei hohen Antikörperkonzentrationen. Dies liegt daran, dass überschüssiger Antikörper sehr winzige Komplexe bildet, die nicht zu sichtbarer Agglutination verklumpen.

Qualitativer Agglutinationstest

Agglutinationstests können in qualitativer Weise verwendet werden, um auf das Vorhandensein eines Antigens oder eines Antikörpers zu testen. Der Antikörper wird mit dem partikulären Antigen gemischt und ein positiver Test wird durch die Agglutination des partikulären Antigens angezeigt.

Um beispielsweise die Blutgruppe des Patienten zu bestimmen, können die roten Blutkörperchen der Person mit Antikörpern gegen ein Blutgruppenantigen gemischt werden. Ein anderes Beispiel ist, dass zum Nachweis des Vorhandenseins von Antikörpern in einer Patientenprobe das Serum des Patienten mit den roten Blutkörperchen (RBC) einer bekannten Blutgruppe gemischt wird.

Quantitativer Agglutinationstest

Um den Gehalt an Antikörpern gegen partikuläre Antigene zu messen, kann der Agglutinationstest weit verbreitet sein. Für diesen Test können serielle Verdünnungen der Probe vorgenommen und auf Antikörper getestet werden. Dann kann eine feste Menge an partikulärem Antigen oder Bakterien oder roten Blutkörperchen hinzugefügt werden. Bestimmen Sie die maximale Verdünnung, die eine Agglutination bildet, und diese maximale Verdünnung, die eine beobachtbare Agglutination ergibt, wird als Titer bezeichnet. Das Ergebnis wird als Kehrwert der maximalen Verdünnung angezeigt, die eine sichtbare Agglutination bildet.

Passive Hämagglutination

Die Empfindlichkeit und Einfachheit von Agglutinationsreaktionen kann durch die Technik der passiven Häm-Agglutination auf lösliche Antigene ausgedehnt werden. Bei dieser Technik werden antigenbeschichtete rote Blutkörperchen hergestellt, indem ein lösliches Antigen mit roten Blutkörperchen gemischt wird, die mit Gerbsäure oder Chromchlorid behandelt wurden, die beide die Adsorption von Antigen an die Oberfläche der Zellen fördern. Es ist jedoch möglich, Erythrozyten mit einem löslichen Antigen (z.B.. b. virales Antigen, ein Polysaccharid oder ein Hapten) und verwenden die beschichteten roten Blutkörperchen in einem Agglutinationstest auf Antikörper gegen das lösliche Antigen.

Seriell verdünntes Serum, das Antikörper enthält, wird auf jede Vertiefung der Mikrotiterplatte geladen, wonach antigenbeschichtete rote Blutkörperchen auf jede Vertiefung aufgebracht werden. Das charakteristische Muster der agglutinierten roten Blutkörperchen auf den Vertiefungen wird als Werkzeug zur Bestimmung der Agglutinationsreaktionen verwendet. Wenn das Antigen partikulär ist, kann das Antigen mit dem Antikörper im Serum reagieren und führt zur Verklumpung des Antigens, was ein positives Ergebnis zeigt.

In den letzten Jahren gab es eine Verschiebung weg von roten Blutkörperchen hin zu synthetischen Partikeln wie Latexperlen. Das Präparat kann entweder sofort verwendet oder zur späteren Verwendung gelagert werden. Die Verwendung von synthetischen Perlen bietet die Vorteile der Konsistenz, Gleichmäßigkeit und Stabilität. Darüber hinaus können Agglutinationsreaktionen mit synthetischen Perlen schnell abgelesen werden, oft innerhalb von 3 bis 5 Minuten nach dem Mischen der Perlen mit der Testprobe. Ob basierend auf roten Blutkörperchen oder den bequemeren und vielseitigeren synthetischen Perlen, Agglutinationsreaktionen sind einfach durchzuführen, erfordern keine teuren Geräte und detektieren kleine Mengen an Antikörpern ( Konzentrationen von nur Nanogramm pro Milliliter).

Der erste Schritt im Test ist die Verknüpfung des Latexpartikels durch die Antikörpermoleküle, die spezifisch an die antigenen Determinanten auf der Oberfläche der Partikel binden. Durch diese Querverbindungen kommt es zu einer Bildung großer Gitter, und diese großen Gitter sedimentieren aufgrund der großen Größe der Klumpen leicht und sind mit bloßem Auge innerhalb von Minuten sichtbar. Der Grad der Agglutination kann bestimmt werden, indem die Aggutinantkonzentration aufgetragen wird, die eine glockenförmige Kurve ergibt. Mit den Latexpartikeln können die Antigen-Antikörper-Komplexe vergrößert werden. Viele der Latex-Agglutinationstests werden manuell durchgeführt und durch visuelle Beobachtung erkannt. Um die Agglutination zu bestimmen, müssen etwa 100 Klumpen vorhanden sein, und diese Klumpen müssen etwa 50 Mikrometer groß sein, um mit dem Auge gesehen zu werden.

Agglutinationshemmungsreaktionen

Wenn der Antikörper vor dem Mischen mit Latex mit Antigen inkubiert wird, wird die Agglutination gehemmt; Dies liegt daran, dass freie Antikörper für die Agglutination nicht verfügbar sind. Bei der Agglutinationshemmung ist die Abwesenheit von Agglutination diagnostisch für Antigen, liefert einen hochempfindlichen Assay für kleine Mengen an Antigen. Zum Beispiel enthalten Schwangerschaftskits für zu Hause mit humanem Choriongonadotropin (HCG-Hormon) beschichtete Latexpartikel und Antikörper gegen HCG. Eine schwangere Frau kann HCG enthalten, das nach der Befruchtung von der sich entwickelnden Plazenta ausgeschieden wird. Die Zugabe von HCG-haltigem Urin hemmt die Agglutination von Latexpartikeln, wenn der Anti-HCG-Antikörper zugegeben wird; und somit wird die Schwangerschaft durch das Fehlen einer Agglutination angezeigt.

Die Latexpartikel

Emulsionspolymerisation ist das Verfahren, das zur Herstellung von Latexpartikeln angewendet wird. Zunächst wird das Styrol mit der Tensidlösung (Natriumdodecylsulfat) vermischt und bildet eine Schicht emulgierter Mizellen mit gleichmäßigem Durchmesser. Dann wird eine kleine Menge Kaliumpersulfat zugegeben, das ein wasserlöslicher Polymerisationsinitiator ist. Nach Beendigung des Polymerisationsprozesses werden die Polystyrolketten in den Mizellen angeordnet. Der Kohlenwasserstoffteil der Polystyrolkette ist an das Zentrum und das terminale Sulfationen an die Polymeroberfläche gebunden, die der Wasserphase ausgesetzt ist. Zur Herstellung der einheitlichen Latexteilchen werden auch andere Kohlenwasserstoffe und deren Derivate verwendet, beispielsweise Styrol-Hydrovinylbenzol, Polymethylmethacrylat, Styrolvinyltoluol, Polyvinyltoluol usw.

Der Prozess der Latexpartikelproduktion ist aus der synthetischen Kautschukproduktion hervorgegangen und auch die Emulsion hat ein milchiges Aussehen, der Begriff Latex wird ihm gegeben .Der gewünschte Durchmesser des Latexpartikels kann durch Modifizierung des Herstellungsverfahrens, der Kohlenwasserstoffe, der Tenside und des Initiators eingestellt werden. Die Partikelgröße von Latexen liegt üblicherweise zwischen 0,05 µm und 2 µm. Aufgrund der Anwesenheit von Sulfat- und Sulfonationen auf der Oberfläche des Partikels, die dem Partikel eine inhärente negative Oberflächenladung verleiht.

Die Latexpartikel können funktionalisiert und oberflächenbehandelt werden, um die Bindungsstabilität zu erleichtern und die Analytbindung zu erhöhen. Funktionelle Behandlungen wie Amidierung, Aminierung, Carboxylierung, Hydroxylierung und sogar Magnetisierung werden verwendet, um die Eigenschaften von Latexpartikeln zu erhöhen. Auch verschiedene Farben von Latexpartikeln sind im Handel erhältlich, die das visuelle Auslesen erleichtern.

Der Latex-Agglutinationstest ist eine klinische Methode zum Nachweis bestimmter Antigene oder Antikörper in einer Vielzahl von Körperflüssigkeiten wie Blut, Speichel, Urin oder Liquor cerebrospinalis. Die zu testende Probe wird ins Labor geschickt und dort mit Latexperlen gemischt, die mit einem spezifischen Antigen oder Antikörper beschichtet sind. Die Verklumpung von Latexperlen (Agglutination) weist auf vermutete Partikel hin.

Latex-Agglutinationstest beinhaltet einige der Vorteile .Sie sind,

1. Fähigkeit, semi-quantitative Ergebnisse zu erhalten.
2. Eine niedrige individuelle Testkosten.
3. Relativ kurze Zeit, um Ergebnisse zu erzielen.

Durch die Durchführung von 2- bis 10-fachen Verdünnungen von Proben können wir die semi-quantitativen Ergebnisse erhalten.Latex-Agglutinationstest haben auch einige Nachteile, die einschließen

1.Müssen marginale Ergebnisse und
2 sorgfältig interpretieren. Probleme mit der Spezifität aufgrund von störenden Substanzen in vielen Assays.