Establecimiento de un Ensayo de Unión Competitivo Que Identifique las Diferentes Características de los Epítopos Neutralizantes del Virus de la Hepatitis E

Resumen

Objetivos: Confirmar las diferentes características de los epítopos neutralizantes comunes y específicos de genotipo del virus de la hepatitis E (VHE). Método: Se estableció un ensayo de unión competitiva con anticuerpos monoclonales neutralizantes comunes a genotipos conocidos (mAbs) 3G1 y 5G5, así como MABS neutralizantes específicos a genotipo 2B1 y 4C5. Se utilizaron como antígenos recubiertos el P166W01 recombinante ORF2 de HEV derivado del genotipo 1 y el p166Chn derivado del genotipo 4 para determinar si los ABM reconocen epítopos independientes, similares o superpuestos. Los MAB se produjeron, purificaron y conjugaron con peroxidasa de rábano picante (HRP). 2B1 conjugado con HRP podía reaccionar solo con p166W01 pero no con p166Chn, 4C5 conjugado con HRP podía reaccionar solo con p166Chn pero no con p166W01, mientras que 3G1 y 5G5 conjugados con HRP podían reaccionar tanto con p166W01 como con p166Chn. Por lo tanto, los ensayos de unión competitiva se realizaron sucesivamente utilizando el antígeno p166W01 y el antígeno p166Chn. Resultados y Conclusión: Los resultados de ensayos de unión competitivos revelaron que la unión de 2B1 conjugado con HRP a p166W01 no podía ser inhibida por 5G5 o 3G1. De manera similar, la unión de 4C5 conjugado con HRP a p166Chn no podía ser inhibida por 5G5 o 3G1. Sin embargo, los mAbs 5G5 y 3G1 bloquearon la unión entre sí a p166W01 y p166Chn, lo que sugiere que los MAB neutralizantes comunes y específicos de genotipo reconocen epítopos independientes.

© 2018 S. Karger AG, Basilea

Introducción

El virus de la hepatitis E (VHE) es un virus de ARN de cadena positiva no desarrollado que se transmite principalmente por vía oral y causa hepatitis E aguda en humanos . La infección por el VHE puede llevar a pronósticos perjudiciales, por ejemplo, fracaso de la vida, hepatitis aguda grave, infección crónica en el órgano trasplantado y en pacientes inmunodeprimidos, y alta mortalidad en mujeres embarazadas . Además de la infección confirmada en seres humanos, los virus de la hepatitis E también infectan a los animales y pueden transmitirse de animales a seres humanos; la incidencia de la infección por hepatitis E en los países desarrollados también ha aumentado significativamente . Estos hallazgos indican que el HEV representa una amenaza para la salud pública en todo el mundo .

Aunque se ha reconocido un serotipo, los aislados de VHE, derivados de diferentes áreas de todo el mundo, podrían clasificarse en 4 genotipos principales . Los EVH de los genotipos 1 y 2 difieren de los genotipos 3 y 4 en sus características epidemiológicas, antigénicas e inmunogénicas .

Hasta la fecha, no está disponible la investigación sobre caracterización de epítopos antigénicos basada principalmente en la proteína estructural del VHE para un sistema de cultivo in vitro . pORF2 es la principal proteína estructural del HEV codificada por ORF2, que es 1 de 3 marcos de lectura abiertos superpuestos (ORF) del genoma viral . Las regiones inmunogénicas predominantes de pORF2 se han localizado en la región C-terminal 2/3, que fueron los principales objetivos del desarrollo de vacunas .

Nuestro estudio anterior ha revelado la existencia de una diferencia de inmunogenicidad entre la vacuna contra la hepatitis E p179 (439-617 aminoácidos de la proteína ORF2) derivada del genotipo 4 y la p239 (Hecolina) derivada del genotipo 1, la diferencia puede atribuirse a la presencia de epítopo(s) específico (s) del genotipo del EVH . Se han utilizado anticuerpos monoclonales (mAbs) producidos en ratones inmunizados, respectivamente, con p166Sar (452-617 aminoácidos de la proteína ORF2) derivados del genotipo 1 y p166Chn derivados del genotipo 4 para confirmar la presencia de epítopo(s) específico (s) del nototipo ge. Además de 2 MAB neutralizantes comunes al genotipo, 3G1 y 5G5, también se obtuvieron 2 MAB neutralizantes específicos al genotipo, 2B1 y 4C5. 2B1 frente a p166Sar podría unirse específicamente a proteínas recombinantes de los genotipos 1 y 2 y neutralizar solo cepas de genotipos 1 y 2 in vitro; 4C5 frente a p166Chn inmunorreaccionó específicamente frente a proteínas recombinantes de los genotipos 3 y 4 y neutralizó solo cepas de genotipos 3 y 4, mientras que 3G1 frente a p166Sar y 5G5 frente a p166Chn pudieron unirse a proteínas recombinantes de los genotipos 1-4 y neutralizar 4 cepas de genotipos . Para un estudio adicional de las diferentes características de los epítopos neutralizantes comunes y específicos del genotipo del VHE, se desarrolló un ensayo de unión competitiva utilizando mAbs 2B1, 3G1, 4C5 y 5G5, para confirmar si los epítopos reconocidos por mAbs son independientes, similares o superpuestos.

Materiales y métodos

Proteínas recombinantes

p166 recombinante fue una proteína truncada de pORF2, las secuencias de nucleótidos se derivaron de las siguientes cepas de VHE: W01 (genotipo 1, JX857689) y China-9829 (genotipo 4, AY789225). Se construyeron plásmidos recombinantes y se expresaron en Escherichia coli . Las 2 proteínas p166 marcadas con His fueron designadas como p166W01 y p166Chn, respectivamente.

Producción de mAb

Se utilizaron un total de 4 MAB neutralizantes, 2B1, 3G1, 4C5 y 5G5 descritos anteriormente para desarrollar un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas competitivo (ELISA). 2B1 y 3G1 se subieron contra p166Sar; 4C5 y 5G5 se subieron contra p166Chn . Los mAbs se produjeron inyectando 106 células de hibridoma en la cavidad peritoneal de un ratón BALB/c; se recolectó líquido de ascitis que contenía mAbs después de 7 a 10 días, se filtró, centrifugó y almacenó a -80°C.

Purificación de mAbs

El líquido de ascitis de mAb se purificó mediante cromatografía de afinidad de columna de proteína G-sepharosa (Sigma, Alemania). Las fracciones que contenían anticuerpos se recolectaron utilizando el tampón de elución ácida (0,1 M glicina-HCl, pH 2,8) de la proteína G inmovilizada y luego se determinaron a 280 nm; la absorbancia a 280 nm (A280) se puede usar para cuantificar aproximadamente los mAbs. Se utilizó electroforesis en gel de poliacrilamida y dodecil sulfato de sodio para confirmar y cuantificar las fracciones purificadas utilizando albúmina sérica bovina .

El acoplamiento de Peroxidasa de Rábano picante a mAbs

Se dializaron MABS purificados contra tampón de carbonato/bicarbonato de 100 mM (pH 9,3 )a 4°C durante la noche. Los anticuerpos se acoplaron a la peroxidasa de rábano picante (HRP) según las instrucciones del fabricante (KPL). Se mezcló aproximadamente 1,5 mg de HRP con 0,5 mg de mAb en un tampón de conjugación de HRP de 0,5 mL de volumen total, agitando suavemente a temperatura ambiente durante 1 h. La mezcla se dejó a temperatura ambiente durante 15 min después de haber agregado 10 µl del agente reductor, y luego se agregó 1 volumen de glicerol destilado para almacenamiento y uso posterior.

Reactividad cruzada de MAB conjugados con HRP a Antígeno Heterólogo p166

Se aplicó el método ELISA para confirmar la reactividad cruzada de MAB conjugados con HRP con antígeno p166W01 y p166Chn . Brevemente, los pocillos de microplacas se cubrieron con 100 ng de antígeno p166W01 y p166Chn, respectivamente, incubados durante 2 h a 37 ° C. A continuación, se eliminaron los antígenos recubiertos; se agregaron 200 µL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía 0,1% de albúmina sérica bovina en los pocillos, y luego se incubaron las microplacas a temperatura ambiente con agitación suave. Dos horas más tarde, se descartó el tampón de bloqueo y se lavaron los pozos dos veces con PBS que contenían 0,05% de Tween-20 (PBST). Se agregaron diluciones seriadas de 2 veces de MAB conjugados con HRP de 1: 400 a 1: 25.600 en PBS de caseína al 1% en los pocillos correspondientes, seguidas de 45 min de incubación a 37°C; la caseína PBS se eliminó lavando 5 veces con PBST. Se añadió sustrato líquido de tetrametilbencidina para el desarrollo de color para incubación a 37°C durante 10 min. Finalmente, se leyó la densidad óptica (DO) de cada pozo a 450 nm, con una longitud de onda de referencia de 630 nm.

Determinación de los Títulos de Antígeno y mAb

Los títulos de antígeno y MAB se determinaron mediante ELISA. Inicialmente, se prepararon diluciones seriadas de 2 veces de MAB conjugados con HRP que iban de 1: 400 a 1: 25.600 en PBS de caseína al 1%, y luego se agregaron a pocillos pre-recubiertos con diluciones seriadas de antígeno p166W01 o p166Chn. Seguido de una incubación de 45 minutos a 37°C, se retiraron los MAB sin unir lavándolos 5 veces con PBST. Se añadió sustrato líquido de tetrametilbencidina para el desarrollo de color para una incubación de 10 minutos a 37°C. Finalmente, se leyó la DO de cada pozo a 450 nm, con una longitud de onda de referencia de 630 nm, para determinar la dilución que se subsaturaba y se obtuvo una lectura de DO de aproximadamente 1,0 a 450 nm, con una longitud de onda de referencia de 630 nm.

Ensayo de unión competitiva

Se investigaron las diferentes características de los epítopos neutralizantes comunes y específicos del genotipo del EVH utilizando un ensayo de unión competitiva por pares establecido con mAbs neutralizantes comunes y específicos del genotipo . Los métodos fueron similares a los procedimientos descritos anteriormente, excepto que se utilizaron p166W01 y p166Chn como antígeno de recubrimiento, respectivamente, y se agregaron mezclas de mAb conjugado con HRP al doble de la concentración y una concentración saturada de mAb no conjugado a los pocillos recubiertos. La DO se midió a 450 nm, con una longitud de onda de referencia de 630 nm. El porcentaje de inhibición se calculó utilizando la fórmula: 100 × . La competencia se calificó como positiva si el porcentaje de inhibición era superior al 50%.

Resultados

Reactividad cruzada de MAB conjugados con HRP a Antígeno heterólogo p166

Se aplicó el método ELISA para evaluar la reactividad cruzada de MAB conjugados con HRP a antígenos p166W01 y p166Chn. Los resultados revelaron que la 2B1 conjugada con HRP en diluciones de 1: 400 a 1: 25.600 reaccionó solo con p166W01, pero no con p166Chn, y la 4C5 conjugada con HRP en diluciones de 1: 400 a 1: 25.600 reaccionó solo con p166Chn. Por el contrario, las 3G1 y 5G5 conjugadas con HRP en diluciones de 1: 400 a 1: 25.600 reaccionaron bien con las 2 proteínas p166 (Fig. 1). Estas observaciones fueron similares a los hallazgos anteriores, 2B1 y 4C5 son mAbs específicos de genotipo, mientras que 3G1 y 5G5 son mAbs comunes de genotipo .

La determinación de los Títulos de Antígeno p166W01 y de mAb Conjugados con HRP para el Ensayo de Unión Competitiva

El antígeno p166W01 se utilizó para establecer el ensayo de unión competitiva de MABS 2B1, 3G1 y 5G5; los títulos adecuados de mAbs y antígeno se determinaron mediante ELISA. Como se muestra en la Tabla 1, después de la titulación cuadrada, cuando la dilución del antígeno p166W01 fue de 1: 400, el 2B1 conjugado con HRP fue de 1: 6.400, el valor medio de la DO fue cercano a 1,0. Mientras tanto, como se muestra en la Tabla 2, cuando la dilución del antígeno fue de 1: 400, la 5G5 conjugada con HRP y la 3G1 conjugada con HRP fueron de 1: 6.400 y 1: 12.800, respectivamente, y el valor medio de la DO fue cercano a 1,0.

Determinación del Antígeno p166Chn y Títulos de mAb Conjugados con HRP para el Ensayo de Unión Competitiva

Se utilizó el antígeno p166Chn para establecer el ensayo de unión competitiva de MABS 4C5, 3G1 y 5G5, también se determinaron los títulos adecuados de mAbs y antígeno mediante ELISA. Como se muestra en la Tabla 3, después de la titulación cuadrada, cuando la dilución del antígeno p166Chn fue de 1: 800, la 4C5 conjugada con HRP fue de 1: 6.400 y el valor medio de la DO fue cercano a 1,0. Mientras tanto, como se muestra en la Tabla 4, cuando la dilución del antígeno fue de 1: 800, las diluciones de 5G5 conjugado con HRP y 3G1 conjugado con HRP fueron de 1: 6.400 y 1: 12.800, respectivamente; el valor promedio de DO fue cercano a 1,0.

Inhibición de la Unión de mAbs a p166W01

Los resultados de la inhibición se muestran en la Tabla 5; la unión del antígeno 2B1 conjugado con HRP al antígeno p166W01 fue inhibida por el antígeno 2B1 no conjugado con una inhibición del 68%. No hubo inhibición significativa entre 2B1 con mAbs 5G5 y 3G1 (27 y 30%). Se obtuvo una inhibición más completa de MABS heterólogas 3G1 y 5G5, ya que la unión de HRP-3G1 al antígeno fue inhibida por 5G5 con una inhibición del 61%, la 5G5 conjugada con HRP al antígeno fue inhibida por 3G1 con una inhibición del 99%. La unión del antígeno HRP-3G1 y HRP-5G5 al antígeno p166W01 también se inhibió casi por completo por sí misma (inhibición del 81 y el 80%). Estos resultados sugieren que 3G1 y 5G5 pueden compartir el mismo epítopo o epítopo superpuesto, sin embargo, 2B1 probablemente reconoce un epítopo diferente.

Inhibición de la unión de mAbs a p166Chn

Los resultados de inhibición se muestran en la Tabla 5: la unión de HRP-4C5 a p166Chn fue inhibida por 4C5 no conjugado con una inhibición del 69%, no se obtuvo una inhibición significativa (25 y 30%) de los otros 2 mAbs 3G1 y 4C5 no conjugados. Sin embargo, se obtuvo una mayor tasa de inhibición de la unión de mAbs 3G1 y 5G5 conjugados con HRP al antígeno, inhibida por 5G5 y 3G1 no conjugados con una inhibición del 65 y el 76%. La unión del antígeno 3G1 conjugado con HRP y del antígeno 5G5 conjugado con HRP al antígeno p166Chn también fue casi inhibida por sí misma. Estos resultados también sugieren que 3G1 y 5G5 pueden compartir el mismo epítopo o epítopo superpuesto, mientras que 4C5 probablemente reconoce un epítopo diferente.

Discusión

Desde que se aisló por primera vez el nuevo VHE porcino , se han notificado anticuerpos anti-VHE en muchos animales, revelando infección por VHE en animales y seres humanos, y esto puede transmitirse de animales a seres humanos . La reducción de la morbilidad y mortalidad por hepatitis E dependía de la prevención de la vacunación y de un diagnóstico eficaz. El conocimiento de los epítopos del VHE fue esencial para la preparación de vacunas y el desarrollo del diagnóstico . La detección de anticuerpos específicos en suero es uno de los principales métodos de diagnóstico, y hay un número creciente de ensayos serológicos para la detección de anticuerpos. Sin embargo, los ensayos utilizados para detectar anticuerpos específicos varían considerablemente en sensibilidad . Algunos ensayos de diagnóstico comerciales basados en antígenos de genotipo 1 o 2 no detectan anticuerpos séricos contra aislados de genotipos 3 o 4 . Se sabe poco sobre los mecanismos subyacentes a la falta de respuesta de los diferentes ensayos de diagnóstico.

En la actualidad, un sistema de cultivo celular in vitro todavía no está disponible para la investigación de VHS. Por lo tanto, el pORF2 que contiene la mayoría de los sitios inmunogénicos se ha utilizado ampliamente para el estudio inmunológico del EVH, con un carácter dependiente de la conformación . La base estructural de un inmunógeno para obtener anticuerpos neutralizantes y protectores es el epítopo neutralizante, que es el principal objetivo del desarrollo de la vacuna contra la hepatitis E. Hemos informado previamente que la proteína p166, una proteína truncada de pORF2, puede modelar el(los) epítopo (s) neutralizador (s) de VHE, y los anticuerpos levantados contra p166 podrían neutralizar de forma cruzada diferentes genotipos de VHE . Además, la vacuna contra la hepatitis E p239 derivada del VHE de genotipo 1 fue eficaz en un ensayo clínico de fase 3 realizado en la provincia de Jiangsu, China, donde el aislado epidémico del VHE es el genotipo 4 . Estos hallazgos revelaron que existen epítopos neutralizantes comunes dentro de los diferentes genotipos de VHE. Además de los epítopos neutralizantes comunes, también se ha confirmado la existencia de epítopos específicos de genotipo para la preparación y caracterización de mAb .

Para identificar aún más la caracterización de epítopos neutralizantes comunes y específicos de genotipo, se estableció el ensayo de inhibición competitiva con MABS neutralizantes comunes, 3G1 y 5G5, y MABS neutralizantes específicos de genotipo, 2B1 y 4C5, para investigar la unión de la competencia al antígeno p166W01 o p166Chn y determinar si los MABS reconocen epítopos independientes, similares o superpuestos.

Inicialmente, los fluidos ascíticos de mAbs 3G1, 2B1, 5G5 y 4C5 fueron producidos, purificados y conjugados con HRP. Se aplicó el método ELISA para comparar la af finidad de unión de los MAB conjugados con HRP con diferentes genotipos de HEV p166. Los resultados revelaron que el conjugado de HRP ed 2B1 solo reaccionó con el genotipo 1 p166W01, pero no con p166Chn. De manera similar, el 4C5 conjugado con HRP reaccionó solo con p166Chn. Por el contrario, las proteínas 3G1 y 5G5 conjugadas con HRP reaccionaron bien contra las proteínas de 2 genotipos p166. Por lo tanto, los ensayos de unión competitiva se basan en los antígenos p166 del genotipo 1 y 4 del HEV. Los resultados de los ensayos de unión competitivos no son sorprendentes, p.ej. que la unión de 2B1 a p166W01 solo competía por sí misma, mientras que 3G1 y 5G5 podían competir entre sí por la unión a p166W01. Además, la unión de 4C5 a p166Chn solo competía por sí misma, pero 3G1 y 5G5 podían competir entre sí por la unión a p166Chn. Estos hallazgos indicaron que 3G1 y 5G5 reconocen los mismos epítopos o que se superponen y que 2B1 y 4C5 reconocen diferentes epítopos.

Este es el primer estudio que investiga las diferentes características de los epítopos neutralizantes conformacionales comunes y específicos del genotipo del VHE. Demostramos que los epítopos neutralizantes comunes y específicos del genotipo pueden ser independientes. Este descubrimiento es muy beneficioso para demostrar los mecanismos subyacentes a la baja concordancia de los diferentes ensayos diagnósticos. Otros estudios son de crucial importancia para dilucidar las diferentes características de los epítopos neutralizantes del VHE en la eficacia del desarrollo diagnóstico y la preparación de vacunas.

Reconocimiento

Este trabajo fue apoyado por la fundación de investigación científica doctoral de la Universidad Médica de Anhui (No.0110037101).

Declaración de divulgación

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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