Objetivo

Para aprender la técnica de aglutinación en látex.

La aglutinación de látex se observa cuando una muestra que contiene el antígeno (o anticuerpo) específico se mezcla con un anticuerpo (o antígeno) recubierto en la superficie de partículas de látex.

Las pruebas de aglutinación en látex se han aplicado en laboratorios clínicos para la detección de enfermedades infecciosas y en 1956 Singer y Plotz describieron por primera vez la Prueba del Factor Reumatoide, una prueba basada en la aglutinación en látex. En la artritis reumatoide( AR), los anticuerpos IgG producidos por los linfocitos en la articulación sinovial reaccionan con los anticuerpos IgM (RF, factor reumatoide) para generar complejos inmunes que activan el complemento y causan la destrucción del tejido. La AR es de importancia diagnóstica.

Desde entonces, muchas empresas de todo el mundo han desarrollado y comercializado pruebas para detectar infecciones microbianas y virales, enfermedades autoinmunes, hormonas, medicamentos y proteínas séricas. El principio se utiliza para diagnosticar muchas infecciones como Hepatitis B, H. influenzae, N. meningitidis, etc.. Todos los métodos de detección o cuantificación de antígenos o anticuerpos aprovechan el hecho de que reaccionan para formar un complejo. A la concentración óptima de antígeno-anticuerpo, este complejo se precipita. Sin embargo, si el antígeno es de naturaleza particulada, se observa aglutinación del complejo antígeno-anticuerpo.

Reacciones de aglutinación

La reacción entre un antígeno particulado y un anticuerpo produce una aglutinación visible llamada aglutinación. Los anticuerpos que producen tales reacciones se conocen como aglutininas. El principio de las reacciones de aglutinación es similar a las reacciones de precipitación; dependen de la unión cruzada de antígenos polivalentes. Cuando el antígeno es un eritrocito, se llama hemaglutinación.Teóricamente, todos los anticuerpos pueden aglutinar antígenos de partículas, pero la IgM, debido a su alta especificidad, es una aglutinina particularmente buena.

No se puede observar aglutinación cuando la concentración de anticuerpos es alta (diluciones más bajas), y luego la muestra se diluye, se produce aglutinación. El efecto prozona se define como la invisibilidad de la aglutinación a altas concentraciones de anticuerpos. Se debe a la razón por la que el exceso de anticuerpos forma complejos muy diminutos que no se agrupan para formar aglutinación visible.

Prueba de aglutinación cualitativa

Las pruebas de aglutinación se pueden utilizar de manera cualitativa para determinar la presencia de un antígeno o un anticuerpo. El anticuerpo se mezcla con el antígeno particulado y la prueba positiva se indica mediante la aglutinación del antígeno particulado.

Por ejemplo, para determinar el grupo sanguíneo del paciente, los glóbulos rojos de la persona se pueden mezclar con anticuerpos para un antígeno del grupo sanguíneo. Otro ejemplo es que para evaluar la presencia de anticuerpos en una muestra de paciente, el suero del paciente se mezcla con los glóbulos rojos de un grupo sanguíneo conocido.

Prueba de aglutinación cuantitativa

Para medir el nivel de anticuerpos contra antígenos particulados, la prueba de aglutinación se puede usar ampliamente. Para esta prueba, se pueden hacer diluciones en serie de la muestra y se analiza para detectar anticuerpos. Luego, se le puede agregar una cantidad fija de antígeno particulado, bacterias o glóbulos rojos. Determinar la dilución máxima que forma la aglutinación y esta dilución máxima que da la aglutinación observable se conoce como el título. Los resultados se muestran como el recíproco de la dilución máxima que forma aglutinación visible.

Hemaglutinación pasiva

La sensibilidad y simplicidad de las reacciones de aglutinación se pueden extender a los antígenos solubles mediante la técnica de aglutinación pasiva del hemo. En esta técnica, los glóbulos rojos recubiertos de antígenos se preparan mezclando un antígeno soluble con glóbulos rojos que han sido tratados con ácido tánico o cloruro de cromo, los cuales promueven la adsorción del antígeno a la superficie de las células. Sin embargo, es posible recubrir los eritrocitos con un antígeno soluble (p. ej.. antígeno viral, un polisacárido o un hapten) y utilizar los glóbulos rojos recubiertos en una prueba de aglutinación para detectar anticuerpos contra el antígeno soluble.

El suero diluido en serie que contiene anticuerpos se carga en cada pocillo de la placa de microtitulación, después de que se aplican glóbulos rojos recubiertos de antígeno a cada pocillo. El patrón característico de glóbulos rojos aglutinados en los pocillos se utiliza como herramienta para evaluar las reacciones de aglutinación. Si el antígeno es particulado, entonces el antígeno puede reaccionar con el anticuerpo en el suero y da lugar a la aglutinación del antígeno que muestra un resultado positivo.

En los últimos años, se ha producido un cambio de los glóbulos rojos a las partículas sintéticas, como las perlas de látex. La preparación puede utilizarse inmediatamente o almacenarse para su uso posterior. El uso de perlas sintéticas ofrece las ventajas de consistencia, uniformidad y estabilidad. Además, las reacciones de aglutinación que emplean perlas sintéticas se pueden leer rápidamente, a menudo entre 3 y 5 minutos después de mezclar las perlas con la muestra de prueba. Ya sea que se basen en glóbulos rojos o en perlas sintéticas más convenientes y versátiles, las reacciones de aglutinación son fáciles de realizar, no requieren equipos costosos y detectan pequeñas cantidades de anticuerpos ( concentraciones tan bajas como nanogramos por mililitro).

El paso inicial de la prueba es la unión de la partícula de látex por las moléculas de anticuerpos que se unen específicamente a los determinantes antigénicos en la superficie de las partículas. Hay una formación de grandes redes a través de estos enlaces cruzados y estas grandes redes se sedimentan fácilmente debido al gran tamaño de los grupos y son visibles a simple vista en cuestión de minutos. El grado de aglutinación se puede determinar trazando la concentración de aglutinante que da una curva en forma de campana. Los complejos antígeno-anticuerpo se pueden ampliar utilizando las partículas de látex. Muchas de las pruebas de aglutinación de látex se realizan manualmente y se detectan mediante observación visual. Para determinar la aglutinación, debe contener aproximadamente 100 grumos, y estos grumos deben tener un tamaño de aproximadamente 50 micrómetros para ser vistos a simple vista.

Reacciones de inhibición de la aglutinación

Si el anticuerpo se incuba con antígeno antes de mezclarse con látex, se inhibe la aglutinación; esto se debe a que no se dispone de anticuerpos libres para la aglutinación. En la inhibición de la aglutinación, la ausencia de aglutinación es un diagnóstico de antígeno, proporciona un ensayo de alta sensibilidad para pequeñas cantidades de antígeno. Por ejemplo, los kits de embarazo caseros contienen partículas de látex recubiertas de gonadotropina coriónica humana (hormona HCG) y anticuerpos contra la HCG. La orina de una mujer embarazada contiene HCG que es secretada por la placenta en desarrollo después de la fertilización. La adición de orina que contiene HCG, inhibe la aglutinación de partículas de látex cuando se agrega el anticuerpo anti-HCG; y por lo tanto, el embarazo está indicado por la ausencia de aglutinación.

La polimerización en emulsión de partículas de látex

es el procedimiento que se aplica para la preparación de partículas de látex. En primer lugar, el estireno se mezcla con la solución surfactante (dodecil sulfato de sodio), forma miles de millones de micelas emulsionadas que tienen un diámetro uniforme. Luego se agrega una pequeña cantidad de persulfato de potasio, que es un iniciador de polimerización soluble en agua. Una vez finalizado el proceso de polimerización, las cadenas de poliestireno se disponen en las micelas. La parte hidrocarbonada de la cadena de poliestireno está unida al centro y el ion sulfato terminal a la superficie de las esferas que está expuesta a la fase acuosa. Otros hidrocarburos y sus derivados también se utilizan para la producción de partículas de látex uniformes, algunos de los ejemplos son el estrireno-dlvinilbenceno, polimetil metacrilato, estireno, vinilo, tolueno, polivinil, etc.

El proceso de producción de partículas de látex evoluciona a partir de la producción de caucho sintético y también la emulsión tiene un aspecto lechoso, se le da el término látex .El diámetro deseado de la partícula de látex se puede obtener modificando el proceso de preparación, los hidrocarburos, los surfactantes y el iniciador. El tamaño de partícula de los látex suele oscilar entre 0,05 µm y 2 µm. Debido a la presencia de iones de sulfato y sulfonato en la superficie de la partícula que proporciona una carga superficial negativa inherente a la partícula.

Las partículas de látex se pueden funcionalizar y tratar la superficie para facilitar la estabilidad de la unión y aumentar la fijación del analito. Los tratamientos funcionales como la amidación, la aminación, la carboxilación, la hidroxilación e incluso la magnetización se utilizan para aumentar las propiedades de las partículas de látex. También hay disponibles comercialmente varios colores de partículas de látex que facilitan la lectura visual.

La prueba de aglutinación en látex es un método clínico para detectar ciertos antígenos o anticuerpos en una variedad de fluidos corporales, como sangre, saliva, orina o líquido cefalorraquídeo. La muestra a analizar se envía al laboratorio, donde se mezcla con perlas de látex recubiertas con un antígeno o anticuerpo específico. La aglutinación de perlas de látex (aglutinación) indica la presencia de partículas sospechosas.

La prueba de aglutinación de látex incluye algunas de las ventajas .Lo son,

1. Capacidad de obtener resultados semicuantitativos.
2. Un costo de prueba individual bajo.
3. Tiempo relativamente corto para obtener resultados.

Realizando diluciones de 2 a 10 veces de las muestras podemos obtener los resultados semicuantitativos .La prueba de aglutinación de látex tiene algunas desventajas que también incluyen

1.Necesidad de interpretar cuidadosamente los resultados marginales y
2. Problemas de especificidad debido a sustancias interferentes en muchos ensayos.