Proteinasa K

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Activada por el calcio, la enzima digiere las proteínas preferentemente después de aminoácidos hidrofóbicos (aminoácidos alifáticos, aromáticos y otros hidrófobos). Aunque los iones de calcio no afectan la actividad enzimática, sí contribuyen a su estabilidad.Las proteínas se digerirán completamente si el tiempo de incubación es largo y la concentración de proteasa lo suficientemente alta. Al eliminar los iones de calcio, la estabilidad de la enzima se reduce, pero la actividad proteolítica permanece. La proteinasa K tiene dos sitios de unión para Ca2+, que se encuentran cerca del centro activo, pero no están directamente involucrados en el mecanismo catalítico. La actividad residual es suficiente para digerir las proteínas, que por lo general contaminan las preparaciones de ácido nucleico. Por lo tanto, la digestión con Proteinasa K para la purificación de ácidos nucleicos se realiza generalmente en presencia de EDTA (inhibición de enzimas dependientes de iones metálicos, como las nucleasas).

La proteinasa K también es estable en un amplio rango de pH (4-12), con un pH óptimo de 8,0.Una elevación de la temperatura de reacción de 37 °C a 50-60 °C puede aumentar la actividad varias veces, como la adición de sulfato de dodecilo de sodio (SDS) de 0,5 a 1% o cloruro de guanidinio (3 M), tiocianato de guanidinio (1 M) y urea (4 M). Las condiciones mencionadas anteriormente aumentan la actividad de la proteinasa K al hacer que los sitios de escisión de su sustrato sean más accesibles. Las temperaturas superiores a 65 ° C, el ácido tricloroacético (TCA) o los inhibidores de la serina proteasa AEBSF, PMSF o DFP inhiben la actividad. La proteinasa K no será inhibida por el cloruro de guanidinio, tiocianato de guanidinio, urea, Sarkosil, Tritón X-100, Tween 20, SDS, citrato, ácido yodoacético, EDTA ni por otros inhibidores de la serina proteasa como la Clorometilcetona Na-Tosil-Lys (TLCK) y la Clorometilcetona Na-Tosil-Phe (TPCK).

Actividad de la proteasa K en tampones de uso común

Tampón (pH = 8,0, 50 ° C, 1,25 µg/mL de proteasa K, 15 min de incubación) Actividad de proteinasa K (%)
30 MM Tris * Cl 100
30 MM Tris * Cl; EDTA de 30 mm; 5% Tween 20; 0,5% Triton X-100; GuHCl de 800 mm 313
36 Tris·Cl mM; EDTA de 36 mM; Interpolación de 5% 20; Tritón X-100 de 0,36%; GuHCl de 735 mm 301
10 MM Tris * Cl; EDTA de 25 mm; NaCl de 100 mM; SDS al 0,5% 128
10 Tris·Cl mM; EDTA de 100 mM; NaCl de 20 mM; Sarkosil al 1% 74
10 MM Tris * Cl; 50 mM KCl; 1,5 mM MgCl2; 0,45% Interpolación 20; 0,5% Tritón X-100 106
10 MM Tris * Cl; EDTA de 100 mm; 0.5% FDS 120
30 Tris * Cl de Mm; EDTA de 10 mm; FDS al 1% 203