Prueba de Bilis-Esculina para la Presunta Identificación de Enterococos y Estreptococos: Efectos de la Concentración Biliar, la Técnica de Inoculación y el Tiempo de Incubación

El reconocimiento y diferenciación de cocos grampositivos catalasa negativos, alfa hemolíticos y no hemolíticos en pares y cadenas como enterococos, estreptococos del grupo D (mainlyStreptococcus bovis) y estreptococos del grupo viridans no del grupo D son clínicamente importantes (10). La prueba de bilis-esculina se usa ampliamente para diferenciar los enterococos y los estreptococos del grupo D, que son tolerantes a la bilis y pueden hidrolizar esculina a esculetina, de los estreptococos del grupo viridans que no pertenecen al grupo D, que crecen mal en la bilis. Descrito por primera vez en 1926 por Meyer y Schonfeld (8), la prueba de bilis-esculina fue demostrada por Facklam y Moody (2, 3, 5) para tener una sensibilidad del 100% y una especificidad del 97% para identificar enterococos y estreptococos del grupo D. Estos resultados se obtuvieron con sesgos de agar que contenían al 4% de oxgall (sales biliares), inoculados con 1 o 2 gotas de un cultivo de Todd-Hewitt de 24 h del organismo (inoculación al»día siguiente»), e incubados durante 48 h. En bacteriología de diagnóstico rutinario, tal protocolo no es práctico, ya que requiere 3 días desde el momento en que se detectan colonias en placas primarias. La mayoría de los libros de texto y manuales de procedimientos recomiendan inocular sesgos de agar directamente de unas pocas colonias (inoculación»el mismo día») en lugar de una subcultura de 24 horas en caldo, pero faltan datos que respalden esta técnica alternativa no estandarizada.

Por lo tanto, evaluamos la sensibilidad y especificidad de la prueba de bilis-esculina con dos métodos diferentes de inoculación en el mismo día (estandarizada y no estandarizada) y dos tiempos de incubación diferentes (24 y 48 h). También comparamos los sesgos de esculina que contienen 2 y 4% de oxgall en formulaciones disponibles actualmente en dos fuentes comerciales principales en los Estados Unidos.

Cocos grampositivos negativos a catalasa en pares y cadenas que forman colonias alfa-hemolíticas o no hemolíticas en agar de sangre de oveja al 5% que fueron positivos para PYR (Murex, Dartford, Reino Unido) y crecieron en caldo de soja triptico que contenía 6,5% de NaCl (Becton Dickinson Microbiology Systems , Cockeysville, Md.) se identificaron como enterococos; se especializaron con el sistema de estreptococos Rápidos API (bioMérieux Vitek, Hazelwood, Mo.). Se identificaron como S. bovis cocos gram positivos negativos a catalasa en pares y cadenas que forman colonias alfahemolíticas o no hemolíticas que eran negativas para PYR, no crecían en NaCl al 6,5%, eran positivas para antígeno del grupo D por aglutinación en látex (Murex) y tenían un patrón bioquímico sugerente (≥90% de probabilidad) por el sistema de estreptococos Rápidos API. Se denominaron estreptococos del grupo viridans los cocos gram positivos negativos a catalasa en pares y cadenas que formaban colonias alfahemolíticas o no hemolíticas que eran negativas para PYR y antígeno del grupo D (y eran insolubles en la bilis si eran alfahemolíticos).

Se probaron un total de 110 cepas enterocócicas (34 Enterococcus faecalis, 15 Enterococcus faecium y 61 cepas no hemolíticas y no especializadas), 30 cepas de S. bovis (2 cepas alfa-hemolíticas y 28 cepas no hemolíticas) y 110 cepas estreptocócicas no del grupo D viridans (83 cepas alfa-hemolíticas y 27 cepas no hemolíticas). Las cepas se aislaron consecutivamente de hemocultivos realizados en el Centro Médico de la Universidad de Duke durante un período de 4 años, a excepción de 19 S. bovisstrains que se obtuvieron de la Clínica Mayo.

Se inocularon bacterias frescas (24 h) en tres inclinaciones de agar esculínico diferentes que no contenían bilis (BDMS), 2% oxgall (equivalente a 20% de bilis) (BDMS) o 4% oxgall (equivalente a 40% de bilis) (Remel, Lenexa, Kans.). A excepción de oxgall, las composiciones de los tres medios eran las mismas. Para cada medio, se utilizaron las dos técnicas de inoculación siguientes: (i) inoculación directa en forma de S no estandarizada de 1 a 10 colonias y (ii) inoculación indirecta estandarizada de 10 µl (asa calibrada) de una suspensión estándar de 0,5 McFarland de bacterias en agua desionizada estéril. Las inclinaciones se incubaron a 35 ° C en aire ambiente (2) con tapas sueltas durante 48 h. Las lecturas se tomaron a las 24 y 48 h. Se consideró una reacción positiva cuando la mitad o más del medio se ennegreció (4).

Con una excepción, las 110 cepas enterocócicas dieron reacciones positivas claras después de 24 y 48 h de incubación (sensibilidad del 99%). El inóculo estandarizado (aproximadamente 106 UFC) era tan sensible como el inóculo más pesado y no estandarizado. Facklam y Moody, usando un inóculo de 107 a 108 UFC en inclinaciones de agar, reportaron una sensibilidad del 100% a las 48 h, pero encontraron que 2 de 76 (5) y 6 de 157 (3) cepas enterocócicas eran bilis-esculina negativas (98% de sensibilidad) después de 24 h de incubación. Swan (13), utilizando un inóculo no estandarizado descrito como placas pesadas y de agar en las que se consideró que cualquier ennegrecimiento era un resultado positivo, obtuvo una sensibilidad del 100% a las 24 h con 121 cepas enterocócicas. Sin embargo, según las publicaciones de Facklam, la mayoría de los libros de texto y manuales de procedimientos recomiendan incubar durante 48 horas antes de informar un resultado negativo.

Las 30 cepas de S. bovis fueron positivas a las 24 y 48 h, independientemente de la concentración biliar o del método de inoculación (sensibilidad al 100%). Facklam (3) reportó una sensibilidad de 94 y 100% a las 24 y 48 h, respectivamente, con 37 cepas de estreptococos del grupo D.

En la tabla 1 se muestran los porcentajes de pruebas de bilis-esculina positivas falsas para 110 cepas estreptocócicas del grupo viridans no pertenecientes al grupo D. Encontramos que la especificidad (100% menos el porcentaje de falsos positivos) era máxima (97%) con un inóculo estandarizado estriado en sesgos de agar que contenía 4% de oxgall y se leyó después de 24 h. Se obtuvieron falsos positivos con dos Streptococcus milleri y un Streptococcus lactis subsp. cintas de diacetilactis. La falta de estandarización del inóculo, la disminución de la concentración de oxgall al 2% y la prolongación del tiempo de incubación a 48 h aumentaron el número de falsos positivos a un máximo de 24%. En estudios previos con un agar esculínico selectivo que contenía azida sódica y solo un 10% de bilis, fueron frecuentes las reacciones positivas con estreptococos del grupo viridans no pertenecientes al grupo D (6, 11, 12). No se han publicado previamente datos sobre el uso de un medio que contenga un 2% de oxgall. Nuestros resultados sugieren que esta concentración es subóptima. Usando oxgall al 4%, Swan (13) encontró dos cepas estreptocócicas del grupo viridans tolerantes a la bilis de 21 aislados; sin embargo, ninguna de las cepas hidrolizó esculina a las 24 h. Facklam et al. especificidades notificadas del 99% a las 24 h (3) y del 81 (4) al 97% (3) a las 48 h con oxgall al 4%.

Se encontró una diferencia sorprendente cuando se compararon los subgrupos de estreptococos del grupo viridans alfa hemolíticos y no hemolíticos no del grupo D para el número de falsos positivos. Para las cepas alfa-hemolíticas, este número fue de 0% después de 24 h y 3% después de 48 h, mientras que para las cepas no hemolíticas fue de 11% después de 24 h y 33% después de 48 h, con 4% de oxgall y un inóculo estandarizado (P = 0.017 para valores de 24 h; prueba exacta de Fisher de dos colas). Esta observación no se ha comunicado anteriormente.

Para muestras que no sean de sangre y sitios normalmente estériles, un diagrama de flujo basado en la prueba de bilis-esculina combinada con tolerancia al NaCl al 6,5% o presencia de PIR es suficiente para la identificación confiable de enterococos. Bilis-esculina-positivo organismos de la sangre y de sitios normalmente estériles deben ser especian. La especiación de enterococos es útil por razones epidemiológicas y porque E. faecium y otras especies tienden a ser más resistentes a los antibióticos que E. faecalis (8, 9). Una identificación definitiva de la ofS. bovis es importante, ya que el organismo está asociado con carcinoma de colon, que debe descartarse en estos pacientes (7). Por otro lado, los informes falsos positivos de la ofS. bovis puede dar lugar a investigaciones innecesarias. La especiación de organismos biliares-esculínicos positivos también permitirá la detección de estreptococos del grupo viridans no del grupo D positivos falsos. Los errores terapéuticos pueden ocurrir con la identificación errónea de estreptococos y enterococos (1). La especiación rutinaria de organismos biliares-esculínicos negativos no es necesaria, ya que los enterococos y los estreptococos del grupo D rara vez dan reacciones negativas falsas.

En conclusión, la prueba de bilis-esculina funciona bien para separar rápidamente enterococos y estreptococos del grupo D de estreptococos del grupo no viridans del grupo D a bajo costo y con buena sensibilidad (>99%) y especificidad (97%), siempre que se realice en inclinaciones de agar que contengan 40% de bilis, se realice con un inóculo estandarizado (10 µl de una suspensión bacteriana estándar de 0,5 McFarland) y se lea a las 24 h.