Purificación de proteínas
la Elección de un material de partida es clave para el diseño de un proceso de purificación. En una planta o un animal, una proteína en particular generalmente no se distribuye de manera homogénea por todo el cuerpo; los diferentes órganos o tejidos tienen concentraciones más altas o más bajas de la proteína. El uso de solo los tejidos u órganos con la mayor concentración disminuye los volúmenes necesarios para producir una cantidad determinada de proteína purificada. Si la proteína está presente en baja abundancia, o si tiene un valor alto, los científicos pueden usar tecnología de ADN recombinante para desarrollar células que producirán grandes cantidades de la proteína deseada (esto se conoce como sistema de expresión). La expresión recombinante permite etiquetar la proteína, por ejemplo, mediante una etiqueta His o una etiqueta estreptocócica para facilitar la purificación, reduciendo el número de pasos de purificación requeridos.
Una purificación analítica generalmente utiliza tres propiedades para separar proteínas. En primer lugar, las proteínas pueden purificarse de acuerdo con sus puntos isoeléctricos pasándolas a través de un gel con grado de pH o una columna de intercambio iónico. En segundo lugar, las proteínas se pueden separar de acuerdo con su tamaño o peso molecular mediante cromatografía de exclusión de tamaño o mediante análisis SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida y dodecil sulfato de sodio). Las proteínas a menudo se purifican mediante el uso de PÁGINAS 2D y luego se analizan mediante huellas dactilares de masa de péptidos para establecer la identidad de la proteína. Esto es muy útil para fines científicos y los límites de detección de proteínas son hoy en día muy bajos y las cantidades de nanogramos de proteína son suficientes para su análisis. En tercer lugar, las proteínas pueden separarse por polaridad/hidrofobicidad mediante cromatografía líquida de alto rendimiento o cromatografía de fase inversa.
Por lo general, un protocolo de purificación de proteínas contiene uno o más pasos cromatográficos. El procedimiento básico en cromatografía es hacer fluir la solución que contiene la proteína a través de una columna llena de diversos materiales. Diferentes proteínas interactúan de manera diferente con el material de la columna, y por lo tanto se pueden separar por el tiempo requerido para pasar la columna, o las condiciones requeridas para eluir la proteína de la columna. Por lo general, las proteínas se detectan a medida que salen de la columna por su absorbancia a 280 nm. Existen muchos métodos cromatográficos diferentes:
Cromatografía de exclusión de tamañoeditar
La cromatografía se puede utilizar para separar proteínas en solución o en condiciones de desnaturalización mediante el uso de geles porosos. Esta técnica se conoce como cromatografía de exclusión de tamaño. El principio es que las moléculas más pequeñas tienen que atravesar un volumen mayor en una matriz porosa. Consecuentemente, las proteínas de un cierto rango de tamaño requerirán un volumen variable de eluyente (solvente) antes de ser recolectadas en el otro extremo de la columna de gel.
En el contexto de la purificación de proteínas, el eluyente generalmente se agrupa en diferentes tubos de ensayo. Se desechan todos los tubos de ensayo que no contengan trazas medibles de la proteína a purificar. La solución restante está hecha de la proteína para purificar y cualquier otra proteína de tamaño similar.
Separación basada en carga o hidrofobicidadeditar
Cromatografía de interacción hidrofóbicaeditar
Los medios HIC son anfifílicos, con regiones hidrofóbicas e hidrofílicas, lo que permite la separación de proteínas en función de su hidrofobicidad superficial. Las proteínas diana y sus especies agregadas de productos tienden a tener diferentes propiedades hidrofóbicas y eliminarlas a través de HIC purifica aún más la proteína de interés. Además, el entorno utilizado normalmente emplea condiciones de desnaturalización menos duras que otras técnicas de cromatografía, lo que ayuda a preservar la proteína de interés en su estado nativo y funcional. En agua pura, las interacciones entre la resina y las regiones hidrofóbicas de la proteína serían muy débiles, pero esta interacción se mejora mediante la aplicación de una muestra de proteína a la resina HIC en tampón de alta resistencia iónica. La fuerza iónica del tampón se reduce a proteínas eluidas en orden de hidrofobicidad decreciente.
Cromatografía de intercambio iónico
La cromatografía de intercambio iónico separa compuestos de acuerdo con la naturaleza y el grado de su carga iónica. La columna a utilizar se selecciona de acuerdo con su tipo y fuerza de carga. Las resinas intercambiadoras de aniones tienen una carga positiva y se utilizan para retener y separar compuestos cargados negativamente (aniones), mientras que las resinas intercambiadoras de cationes tienen una carga negativa y se utilizan para separar moléculas cargadas positivamente (cationes).
Antes de que comience la separación, se bombea un tampón a través de la columna para equilibrar los iones cargados opuestos. Tras la inyección de la muestra, las moléculas de soluto se intercambiarán con los iones tampón a medida que cada uno compite por los sitios de unión de la resina. La duración de retención de cada soluto depende de la fuerza de su carga. Los compuestos con carga más débil se eluirán primero, seguidos por aquellos con cargas sucesivamente más fuertes. Debido a la naturaleza del mecanismo de separación, el pH, el tipo de tampón, la concentración de tampón y la temperatura juegan un papel importante en el control de la separación.
La cromatografía de intercambio iónico es una herramienta muy potente para su uso en la purificación de proteínas y se utiliza con frecuencia en separaciones analíticas y preparativas.
flujo Libre-electrophoresisEdit
La electroforesis de flujo libre (FFE) es una técnica de electroforesis sin portadores que permite la separación de proteínas preparativa en una corriente tampón laminar mediante el uso de un campo eléctrico ortogonal. Al hacer uso de un gradiente de pH, que por ejemplo puede ser inducido por anfólitos, esta técnica permite separar isoformas de proteínas hasta una resolución de < 0,02 delta-pI.
Cromatografía de afinidadeditar
La cromatografía de afinidad es una técnica de separación basada en la conformación molecular, que utiliza con frecuencia resinas específicas de la aplicación. Estas resinas tienen ligandos unidos a sus superficies que son específicos para los compuestos a separar. Con mayor frecuencia, estos ligandos funcionan de manera similar a la de las interacciones anticuerpo-antígeno. Este ajuste de «cerradura y llave» entre el ligando y su compuesto objetivo lo hace altamente específico, generando con frecuencia un solo pico, mientras que todo lo demás en la muestra no está restringido.
Muchas proteínas de membrana son glicoproteínas y pueden purificarse mediante cromatografía de afinidad por lectina. Se puede permitir que las proteínas solubilizadas con detergente se unan a una resina de cromatografía que haya sido modificada para tener una lectina unida covalentemente. Las proteínas que no se unen a la lectina se lavan y luego se pueden eluir glicoproteínas específicamente unidas agregando una alta concentración de azúcar que compita con las glicoproteínas unidas en el sitio de unión de la lectina. Algunas lectinas tienen una unión de alta afinidad a oligosacáridos de glicoproteínas que es difícil de competir con los azúcares, y las glicoproteínas unidas deben liberarse desnaturalizando la lectina.
Cromatografía de Inmunoafinidadeditar
La cromatografía de inmunoafinidad utiliza la unión específica de un antígeno-anticuerpo para purificar selectivamente la proteína diana. El procedimiento consiste en inmovilizar una proteína a un sustrato sólido (por ejemplo, un cordón poroso o una membrana), que luego se une selectivamente al objetivo, mientras que todo lo demás fluye a través. La proteína objetivo se puede eluir cambiando el pH o la salinidad. El ligando inmovilizado puede ser un anticuerpo (como la inmunoglobulina G) o una proteína (como la proteína A). Debido a que este método no implica ingeniería en una etiqueta, se puede usar para proteínas de fuentes naturales.
Purificación de una proteína etiquetadaeditar
Otra forma de etiquetar proteínas es diseñar una etiqueta de péptido antígeno en la proteína, y luego purificar la proteína en una columna o incubando con una resina suelta que está recubierta con un anticuerpo inmovilizado. Este procedimiento en particular se conoce como inmunoprecipitación. La inmunoprecipitación es bastante capaz de generar una interacción extremadamente específica que generalmente resulta en la unión solo de la proteína deseada. Las proteínas etiquetadas purificadas pueden separarse fácilmente de las otras proteínas en solución y luego eluirse de nuevo en solución limpia.
Cuando las etiquetas ya no son necesarias, pueden ser escindidas por una proteasa. Esto a menudo implica la ingeniería de un sitio de escisión de proteasa entre la etiqueta y la proteína.
HPLCEdit
La cromatografía líquida de alto rendimiento o cromatografía líquida de alta presión es una forma de cromatografía que aplica alta presión para conducir los solutos a través de la columna más rápido. Esto significa que la difusión es limitada y se mejora la resolución. La forma más común es la CLAR de «fase inversa», donde el material de la columna es hidrofóbico. Las proteínas son eluidas por un gradiente de cantidades crecientes de un solvente orgánico, como el acetonitrilo. Las proteínas elute de acuerdo a su hidrofobicidad. Después de la purificación por HPLC, la proteína se encuentra en una solución que solo contiene compuestos volátiles y puede liofilizarse fácilmente. La purificación por HPLC con frecuencia resulta en la desnaturalización de las proteínas purificadas y, por lo tanto, no es aplicable a las proteínas que no se vuelven a plegar espontáneamente.