¿Qué es Southern Blotting?

Por Hannah Simmons, M. Sc.Revisado por Kate Anderton, B.Sc. (Editor)

El borrado es el proceso por el cual el ADN, el ARN o las proteínas se transfieren a una membrana para ser visualizados.

Crédito: Paul Cowan/.com

El primero de estos métodos fue Southern Blotting, desarrollado en 1975 por Edward Southern, y se utiliza para detectar la secuencia de fragmentos de ADN. Desde entonces, se han desarrollado otros dos métodos, llamados Northern y Western blotting. Estos son procesos que se utilizan para identificar secuencias de ARN y proteínas, respectivamente.

Metodología de Southern blotting

Los fragmentos de ADN se generan inicialmente con enzimas de restricción y se separan por tamaño en un proceso llamado electroforesis en gel. Alcalino se utiliza entonces para desnaturalizar el ADN de doble cadena, formando hebras individuales. A continuación, el ADN se transfiere a una lámina de nitrocelulosa o nailon colocando una membrana sobre el gel y utilizando el flujo de tampón para estimular el movimiento del ADN del gel a la membrana.

El flujo capilar y la transferencia al vacío son los dos métodos más comunes utilizados para transferir los fragmentos de ADN. En el flujo capilar, el gel se coloca por encima del nivel de tampón en un bloque de soporte con una membrana colocada en la parte superior. Una pila de toallas absorbentes se colocan sobre la membrana y se utilizan para absorber el tampón de debajo del gel, levantando los fragmentos de ADN hacia la membrana.

Mediante transferencia de vacío, la membrana se coloca debajo del gel y ambas se sumergen en un tampón. A continuación, se utiliza un vacío para crear un flujo que tira de los fragmentos de ADN hacia la membrana.

El calentamiento o la radiación UV se utilizan para garantizar que los fragmentos de ADN permanezcan unidos a la membrana de forma permanente, manteniendo al mismo tiempo la disposición específica del ADN. Las sondas etiquetadas de una sola cadena se utilizan para unirse a las secuencias objetivo.

La lámina se incuba con estas sondas y solo se unen las sondas complementarias. Las sondas no complementarias se lavan de la membrana, asegurando que solo queden las sondas unidas. Estas sondas pueden ser detectadas por autorradiografía para revelar el patrón de hibridación en una película de rayos X.

Aplicaciones de Southern blotting

Southern blotting tiene muchos usos diferentes. En primer lugar, se pueden analizar los reordenamientos genéticos. Por ejemplo, en inmunología, este método se puede usar para identificar los reordenamientos clonales de los genes receptores de células T. En segundo lugar, se pueden identificar fragmentos específicos de ADN a partir de una mezcla de muchos otros fragmentos.

Otros ejemplos de uso incluyen el análisis de polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP) y de repetición en tándem de número variable (VNTR). El RFLP utiliza las diferencias de longitud en las secuencias de ADN homólogo para mapear genomas, y se puede usar en pruebas forenses y de paternidad.

El análisis VNTR utiliza las diferencias en la longitud de secuencias repetidas de nucleótidos para formar una huella dactilar de ADN, un método que se usa comúnmente en pruebas forenses y de paternidad.

Estos métodos también se pueden utilizar en el diagnóstico de enfermedades causadas por mutaciones, por ejemplo, anemia falciforme. Esta condición genética se debe a un polimorfismo de un solo nucleótido (A a T) en el gen de la beta-globina, lo que resulta en hemoglobina anormal.

Los blots sureños para el síndrome del cromosoma X Frágil

Se han utilizado ampliamente para ayudar a identificar genes con regiones de repetición amplificadas. Se trata de secuencias cortas y repetitivas en el ADN que no codifican productos genéticos. Un ejemplo en el que la punción del sur puede ser útil es en el diagnóstico del síndrome del cromosoma X Frágil. Esta condición genética se debe al aumento de la región de repetición de CGG/CCG que se encuentra dentro del gen FMR1.

Este gen generalmente contiene entre 5 y 40 regiones de repetición. Los individuos con 55-200 repeticiones tienen una premutación del gen FMR1, y los individuos con >200 repeticiones tienen síndrome del cromosoma X frágil. El aumento de repeticiones conduce a la metilación del gen, que inhibe la transcripción e impide la producción de la proteína FMRP. Esta proteína es necesaria para el funcionamiento normal del sistema nervioso, por lo tanto, la pérdida de la función proteica conduce a los síntomas del síndrome del cromosoma X frágil.

En el diagnóstico, la enzima de restricción sensible a la metilación EclX1 y la enzima insensible a la metilación EcoR1 se utilizan para permitir la diferenciación de alelos metilados y alelos no metilados. Los alelos metilados se cortan una sola vez para obtener un fragmento de ADN singular de 5,1 kb.

Sin embargo, los alelos no metilados se cortan dos veces, produciendo un fragmento de 2,8 kb. Por lo tanto, las repeticiones de premutación no metiladas (<200) se pueden distinguir de las repeticiones de mutación metiladas de alrededor de 200 repeticiones de largo, ya que el blot sureño se puede usar para identificar los tamaños de los fragmentos de ADN.

Perspectivas de futuro

En general, el frotis sureño es un método importante para el diagnóstico y el estudio de enfermedades (como el síndrome del cromosoma X frágil y la anemia falciforme) y el análisis del ADN por otras razones (como las pruebas forenses y de paternidad).

Sin embargo, el borrado sureño es muy complejo técnicamente, costoso, laborioso y requiere una gran cantidad de muestra de ADN. Por lo tanto, los nuevos métodos están reemplazando lentamente a los secantes meridionales, por ejemplo, la PCR en tiempo real. Este proceso es mucho más fácil y rápido que el del sur y solo requiere un volumen muy pequeño de ADN.

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Escrito por

Hannah Simmons

Hannah es una escritora de ciencias médicas y biológicas con una Maestría en Ciencias (M.Sc.) título de la Universidad de Lancaster, Reino Unido. Antes de convertirse en escritora, la investigación de Hannah se centró en el descubrimiento de biomarcadores para la enfermedad de Alzheimer y Parkinson. También trabajó para dilucidar aún más las vías biológicas involucradas en estas enfermedades. Fuera de su trabajo, a Hannah le gusta nadar, pasear a su perro y viajar por el mundo.

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