Tirosinasa
8.14.2.2.4 Tirosinasa (EC 1.14.18.1) y catecol oxidasa (EC 1.10.3.1)
La Tirosinasa, que pertenece a una familia de proteínas que tiene el centro catalítico formado por cobre dinuclear tipo 3, cataliza la ortohidroxilación de monofenol y la posterior oxidación del producto difenólico a la quinona resultante.178 Se produce una serie de reacciones bajo la reducción concomitante de oxígeno molecular a agua. El producto de quinona es un precursor reactivo para la síntesis de pigmentos de melanina. La tirosinasa, que está contenida en verduras, frutas y champiñones, es una enzima clave en el bronceado que se produce cuando se producen moretones o se almacena a largo plazo. En los mamíferos, la enzima es responsable de anomalías en la pigmentación de la piel, como manchas y defectos.179 Por lo tanto, la tirosinasa es bastante significativa en los campos de la agricultura y la industria. En la industria cosmética, el desarrollo y la detección de inhibidores potentes de la tirosinasa son especialmente atractivos.
La tirosinasa se clasifica en la familia de proteínas de cobre de tipo 3, al igual que la catecol oxidasa y el pigmento respiratorio hemocianina. Durante la reacción catalítica, el centro de cobre tipo 3 de la tirosinasa existe en tres formas redox.178 La forma desoxi (Cu (I– – Cu (I)) es una especie reducida, que se une al oxígeno para dar la forma oxi (Cu(II)–O22 Cu Cu(II)). En la forma oxi, el oxígeno molecular se une como peróxido en un modo de puente lateral μ-η2:η2, que desestabiliza el enlace O-O y lo activa. La forma met (Cu (II) – Cu(II)) se asume como una forma enzimática en reposo, donde los iones Cu(II) normalmente se conectan a un ligando pequeño, como una molécula de agua o un ion hidróxido.
La catecol oxidasa oxida los orto-difenoles a las quinonas correspondientes, pero carece de actividad monooxigenasa o cresolasa. La hemocianina actúa como portador de oxígeno en artrópodos y moluscos.
Se han determinado las estructuras cristalinas de la tirosinasa de Streptomyces castaneoglobisporus HUT 620268 y de la catecol oxidasa de la batata Ipomoea batatas180. Confirman que la coordinación del sitio de cobre tipo 3 en la tirosinasa y la catecol oxidasa es muy similar a la que se encuentra en la hemocianina. Esto se había deducido antes de la similitud de las propiedades espectroscópicas y una comparación de muchas estructuras primarias de tirosinasa y hemocianina.181-183 Sobre la base de la fuente biológica de las proteínas, se pudieron identificar siete organizaciones de dominios diferentes. Las catecol oxidasas vegetales de diferentes organismos tienen una identidad de secuencia de aproximadamente 40-60%. La identidad de la secuencia entre las catecol oxidasas y las hemocianinas mulluscas es de aproximadamente el 35% en casi toda la longitud de las secuencias. En contraste, la identidad de secuencia entre las catecol oxidasas vegetales y otras proteínas de cobre de tipo 3 de cualquier fuente no vegetal se limita a las dos regiones de unión al cobre.
Las dos regiones de unión al cobre muestran la mayor conservación en todas las proteínas de cobre tipo 3. Especialmente la región de unión al CuB está altamente conservada, mientras que la región de unión al CuA muestra más variedad de secuencias y se ha considerado responsable de las diferentes funciones de la tirosinasa, catecol oxidasa y hemocianina.
La estructura general de la tirosinasa de S. castaneoglobisporus en complejo con marco de lectura abierto ORF378 se muestra en la Figura 23. La tirosinasa toma estructuras α-helicoidales con el núcleo de la enzima, que está formado por un haz de cuatro hélices. El centro de cobre dinuclear catalítico está alojado en el haz helicoidal (Figura 23). Cada uno de los dos iones de cobre en un sitio activo está coordinado por tres residuos His (Figura 24), que se derivan de las cuatro hélices del haz α, excepto His54. Un ion de cobre (designado CuA) está coordinado por His38, His54 y His63. His38 y His63 se encuentran en el centro de α2 y α3, respectivamente. El segundo ion de cobre (CuB) está coordinado por His190, His194 y His216. Los residuos His190 y His194 están al principio y en el centro de α6, respectivamente, y His216 está en el centro de α7. Este centro de dicopper se encuentra en la parte inferior de la gran concavidad como un supuesto bolsillo de unión al sustrato, que está formado por los residuos hidrofóbicos. Además de la estructura helicoidal, la tirosinasa tiene algunas estructuras β, según se juzga a partir de los ángulos de torsión de la columna vertebral. En estos, solo los hilos β de los terminales N y C forman una estructura de lámina.
Figura 23. Diagrama de cinta de tirosinasa de Streptomyces castaneoglobisporus en complejo con ORF378 (código PDB: 1WX3). La tirosinasa y ORF378 se muestran en rosa y frambuesa, respectivamente. Los iones de cobre CuA y CuB se representan como esferas amarillas; preparadas con PiMOL (W. L. DeLano, Palo Alto, 2003).
la Figura 24. La forma met del centro activo de tirosinasa de Streptomyces castaneoglobisporus (código PDB: 1WX3); preparado con PiMOL (W. L. DeLano, Palo Alto, 2003).
Aunque la secuencia de aminoácidos de la tirosinasa tiene solo un 25,3 y un 26,0% de identidades con las de la catecol oxidasa I. batatas 180 y el dominio odg de la hemocianina Octopus dofleini 184,respectivamente, su estructura general es bastante similar a la de ellos. Entre estas tres proteínas, se observa un alto grado de conservación en el dominio central compuesto por el haz α. La tirosinasa y hemocianinas de Panulirus interruputus185 y L. polyphemus66 no muestra homología significativa ni semejanza en sus estructuras, pero los dominios del núcleo catalítico de estas proteínas son superponibles.
Para la tirosinasa de S. castaneoglobisporus se pueden caracterizar cinco estados diferentes del sitio activo en estructuras cristalinas, a saber, forma libre de cobre, forma met I, forma met II, desoxi y oxi. En las estructuras cristalinas de catecol oxidasa de I. batatas se han dilucidado los estados met y desoxi, así como un complejo inhibidor. En el estado met (Cu (II), Cu(II)) los dos iones cúpricos están a una distancia de 2.9 Å, cada uno de ellos coordinado por tres histidinas. Están puenteados por otro átomo, muy probablemente un ion hidróxido, a una distancia de aproximadamente 1,8 Å de cada ion cúprico, de modo que cada uno de ellos tiene un número de coordinación de 4 (véase la Figura 24, que muestra la misma situación para la tirosinasa de S. castaneoglobisporus). En el estado desoxi o reducido, ambos átomos de cobre están en el estado de oxidación +1. La distancia cobre–cobre es de 4,4 Å. Los números de coordinación son 4 para CuA (tres ligandos de histidina y una molécula de agua coordinadora) y 3 para CuB (tres ligandos de histidina). La esfera de coordinación está distorsionada, trigonal piramidal para CuA y cuadrada plana para CuB (el sitio de coordinación ocupado por el puente OH− en el estado met está vacío). En el complejo inhibidor con feniltiourea (PTU), la distancia cobre–cobre aumenta a 4,2 Å con el átomo de azufre de PTU reemplazando el puente hidroxo del estado met. Las esferas de coordinación de los dos policías siguen siendo similares a las del estado met, pero hay cambios conformacionales en los residuos del sitio activo. El cambio más significativo es una rotación del anillo aromático de Phe261 (numeración de catecol oxidasa).
En comparación con el estado met, los residuos de coordinación solo tienen posiciones ligeramente diferentes en el estado reducido, lo que indica una bolsa bastante rígida. Los cambios en la coordinación están asociados con los movimientos de los átomos de cobre en la bolsa. El complejo inhibidor muestra que Phe261 se encuentra por encima del sitio activo como una puerta, que gira después de que el inhibidor se une. Por lo tanto, el acceso del sustrato al centro de metal catalítico parece estar controlado por este ‘residuo de puerta’.
El mecanismo catalítico de la tirosinasa fue estudiado por primera vez en detalle por Solomon et al.178 Solomon propuso un mecanismo para las actividades de la cresolasa y la catecolasa de la tirosinasa (Figura 25). Este mecanismo sugiere que el estado oxi es el punto de partida de la actividad de la cresolasa (círculo interno). Este estado está presente en la forma de reposo de la tirosinasa en una proporción de aproximadamente el 15% (estado met del 85%). Un sustrato de monofenol se une al estado oxi y es monooxigenado a o-difenol. Este difenol se une posteriormente al centro de cobre de la tirosinasa met en un modo de unión bidentado propuesto sobre la base de un compuesto modelo.188 La oxidación del sustrato de difenol conduce al estado reducido del centro dinuclear de cobre. La reoxidación del estado reducido al estado oxi ocurre por ataque de dioxigen y cierra el ciclo catalítico.
la Figura 25. Mecanismo de actividad de la cresolasa y la catecolasa de la tirosinasa y la catecol oxidasa desarrollado sobre la base de una propuesta inicial de Solomon y colaboradores 178 e incluyendo resultados más recientes.186,187 Reproducido de C. Gerdemann; C. Eicken; B. Krebs, Acc. Chem. Res. 2002, 35, 183-191, con permiso de la American Chemical Society.
El mecanismo de la actividad de la catecolasa (círculo exterior) comienza a partir de los estados oxi y met. Un sustrato de difenol se une al estado met (por ejemplo), seguido de la oxidación del sustrato a la primera quinona y la formación del estado reducido de la enzima. La unión del dioxígeno conduce al estado oxi, que posteriormente es atacado por la segunda molécula de difenol. La oxidación a la segunda quinona forma de nuevo el estado met y cierra el ciclo catalítico.
Los mecanismos de reacción alternativos incluyen un mecanismo radical propuesto por Kitajima y Morooka189 y un mecanismo que involucra un intermedio Cu (III) basado en mediciones de compuestos modelo.190 Sobre la base de la estructura cristalina del complejo inhibidor de catecol oxidasa–PTU, se sugirió la unión monodentada del sustrato para la catecol oxidasa.180 Un mecanismo radical, como se propone para la actividad catecolasa débil que se encuentra en la hemocianina de Octopus vulgaris,191 también es posible para la catecol oxidasa debido a la fuerte relación estructural entre la catecol oxidasa de I. batatas y la hemocianina odg como se describió anteriormente.
La diferencia distintiva entre catecol oxidasa y tirosinasa aún no se ha explicado. Se ha encontrado y estudiado una fase de retraso en la actividad de la monofenolasa de la tirosinasa, y se propone que sea el resultado de la inhibición temporal del estado met de la tirosinasa por exceso del sustrato de monofenol (Figura 25).186 La actividad de la monofenolasa aumenta cuando el producto difenol desplaza el monofenol de la tirosinasa met y permite la continuación del ciclo catalítico. La catecol oxidasa en su forma aislada está presente exclusivamente en el estado met y también es inhibida por el fenol. Por lo tanto, se sugirió que la falta del estado oxi es la razón por la que la catecol oxidasa carece de actividad cresolasa. Como oxy catecol oxidasa también muestra ninguna actividad monooxigenasa, esta explicación no parece del todo satisfactoria. Otra posible razón es que el acceso a CuA, que se ha propuesto que es necesario para la oxigenación de monofenoles192, está bloqueado en la estructura cristalina de la catecol oxidasa de I. batatas.