Toxina de Clostridium difficile B
Cuando el residuo catalítico de treonina de la glucosiltransferasa desactiva una familia de GTPasas pequeñas, por ejemplo, la familia Rho; Rac y Cdc42 dentro de las células diana perturban los mecanismos de transducción de señales, lo que conduce a un disfuncionamiento del citoesqueleto de actina, la unión célula-célula y la apoptosis (Fig. 5). Rho induce la actividad de las fibras de estrés de actina. Las proteínas Rac controlan las actividades de la ondulación de la membrana y de los neutrófilos de NADPH-oxidasa. Cdc42 regula la formación de filamentos de actina F en filopodios.
citotoxicidadeditar
Figura 3: La toxina B cambia la dinámica de la estructura celular. Imágenes de SEM: a) células de control y b) células tratadas con TcdB durante 18 horas. La flecha negra indica la ubicación del sangrado de la superficie celular.
Varios estudios han demostrado que la presencia de TcdB en células de mamíferos conduce a cambios rápidos dentro de la morfología celular y la señalización celular. En un corto período de tiempo, las células tienen la apariencia de placa con pequeñas dosis de TcdB y TcdA. Además, la muerte de las células es un impacto importante de estas toxinas después de que las células se han intoxicado. Una investigación de Donta et al., señaló que el TcdB tiene graves impactos en otras células de mamíferos, como las células de ovario de hámster chino, las células epiteliales cervicales humanas, las células suprarrenales de ratón, los hepatocitos de rata y los astrocitos de rata (Fig.3).
La actividad citotóxica se basa en los tipos celulares, que pueden variar de 4 a 200 veces. Generalmente, cuando las células se infectan con TcdB, no solo pierden su integridad estructural, sino también la disminución de los filamentos de actina F. El redondeo de celdas por TcdB no tarda más de 2 horas (Fig. 4), pero en cuanto a la muerte celular, puede tomar aproximadamente 24 horas. Con respecto a la diarrea asociada a Clostridium difficile (CDAD), los efectos de la citopaticidad son más críticos que la muerte celular real porque una vez que las células pierden la integridad del filamento de actina del citoesqueleto, también pierden su función normal.
Figura 4: Efectos de la toxina B en los astrocitos de rata. Esta es una probable ilustración de astrocitos de rata incubados con 100 ng/ml de toxina B durante 2 horas a 37 °C.
Efectos en pequeñas GTPasedItar
La causa de la actividad citotóxica de la TcdB dentro de la célula huésped está mediada principalmente por la endocitosis del receptor. Los endosomas ácidos permiten que la toxina B entre al citosol. Este fenómeno tiene lugar por una región receptora de unión, que permite que la toxina entre en las células huésped. A través de la accesibilidad del citosol de las células huésped, TcdB desactiva las GTPasas pequeñas (Fig. 5), por ejemplo, los miembros de la familia Rho Rac y Cdc42 por el proceso de glicosilación de treonina 35 en Cdc42 y Rac, y treonina 37 en Rho. Estas GTPasas Rho se encuentran ubicuamente en el citosol de las células eucariotas que son responsables de la organización del citoesqueleto de actina porque las toxinas en el citosol causan condensación de los filamentos de actina como consecuencia del redondeo celular y la formación de burbujas en la membrana (Fig. 3), que en última instancia conduce a la apoptosis. TcdB causa cambios críticos en la dinámica y morfología celular. La Figura 3 muestra el efecto probable de la toxina B en la superficie de una célula; sangrado de membrana (flechas negras). Además, TcdB inactiva las GTPasas Rho. Como consecuencia, se interrumpen las uniones célula-célula, lo que mejora la permeabilidad epitelial de la toxina B y la acumulación de líquido en el lumen. Este es uno de los principales agentes causantes de la diarrea asociada a Clostridium difficile (DAVD)(Fig. 5).
Figura 5: Modificaciones intracelulares por TcdB. En primer lugar, la toxina B se une a la superficie de la célula y es internalizada por endocitosis mediada por receptores. En segundo lugar, la acidificación del endosoma desencadena la formación de un poro a través del cual se trasloca el GTD. En tercer lugar, la absorción por la UDP-glucosa ayuda a unirse a las GTPasas y liberarlas en el citosol. Finalmente, los glucosilatos GTD GTPasas de la familia Rho en la membrana celular y controlan la regulación de la transcripción y, en última instancia, la apoptosis de la célula.
Además, la tasa de hidrólisis por TcdB de UDP-glucosa es aproximadamente cinco veces mayor que la TcdA. Varios estudios han indicado que el Rho exhibe modificación postraduccional a través de prenilación y carboximetilación, que ocurre en el lado citoplasmático de la membrana plasmática, por lo tanto, el intercambio de GTP a GDP. Cuando el TcdB se une a Rho y otras GTPasas pequeñas, el GTP se hidroliza al PIB, lo que conduce a la unión al GTP (activa) a la unión al PIB (inactiva) (Fig. 5). Además, esta actividad de intercambio está regulada por factores de guanina en el citosol de la célula.
Alteración en las vías de señaleditar
La regulación celular de Rho, Rac y Cdc42 tiene efectos fuera de la vecindad de los filamentos de actina del citoesqueleto (Fig. 4), estas pequeñas GTPasas se incorporan en el ciclo celular que regula las señales a través de las proteínas quinasas quinasas activadas por mitógenos (MAPKKs). Algunas partes fisiológicas de las células que no están involucradas en los filamentos de actina, pueden no causar el redondeo celular o la muerte celular de inmediato, pero en la actividad de la vía descendente, pueden conducir al deterioro de los filamentos de actina y, finalmente, a la muerte celular.
En 1993, un estudio realizado por Shoshan et al., mostró que las células con TcdB cambiaron la actividad de la fosfolipasa A2. Este fue un evento independiente de la interrupción del citoesqueleto de actina. Shoshan et al., también mostró que TcdB inhibía la actividad de señalización del receptor desactivando las proteínas Rho a través de la fosfolipasa D.
Formación de poroseditar
TcdB accede al interior de la célula a través de la endocitosis mediada por clatrina, cuando la toxina B es parte del citosol, la glucosiltransferasa pasa a través de la membrana endosómica, lo que disminuye el pH, induce la translocación y finalmente conduce a cambios morfológicos de los residuos de la región de translocación (958-1130). Las regiones hidrofóbicas están incrustadas en la membrana del huésped para formar poros que permiten el paso de los dominios de la glucosiltransferasa. Cuando las células se infectan con TcdB en un ambiente ácido, atenúa las toxinas y provoca cambios de forma (Fig. 6). Como consecuencia del pH ácido, TcdB muestra claras diferencias en la fluorescencia original del triptófano, la susceptibilidad de las proteasas y las superficies hidrofóbicas. Otro grupo ha demostrado que la acidificación conduce a cambios conformacionales de la toxina y, lo que es más importante, ayuda a formar poros. Una región de traslocación putativa (Fig. 2) constituye aproximadamente 801-1400 aminoácidos, de los cuales los residuos 958-1130 son hidrofóbicos y son responsables de la formación de poros transmembranosos. La mayoría de los estudios utilizaron la cepa 630 de TcdB para mostrar la actividad de formación de poros de las toxinas de C. difficile.
Inducido por pHEdit
Para ver si los efectos de la escisión proteolítica de TcdB tienen lugar en la superficie celular o en endosomas ácidos, los estudios utilizaron Bafilomicina A1, que se sabe que bloquea las H+-ATPasas de tipo v de los endosomas. Esto reduce la acidez en los endosomas. La vía de captación fisiológica de la TcdB impide la actividad citopática de la TcdB. Cuando las células estaban en condiciones ácidas (pH 4,0) durante 5 minutos después de unirse a TcdB a la superficie celular a 37 grados Celsius, se observaron reordenamientos de forma y redondeo. Sin embargo, cuando se incubaron células redondeadas durante una hora adicional en pH neutro (7,0) con parámetros similares, no se observó redondeo celular. Ambos estudios mostraron que la toxina B tiene una propiedad de escisión proteolítica, que es crítica para el acceso al citosol. Tener un pH endosómico ácido conduce a alteraciones topológicas de TcdB (Figura 6).
Figura 6: Dominio de organización de TcdB.Mostrando la diferencia entre pH neutro y ácido (4).
Genéticoseditar
El gen que codifica la proteína TcdB, tcdB, se encuentra dentro de la región cromosómica de 19,6 kb. Esto se conoce como el locus de patogenicidad o PaLoc (Figura 2). El marco de lectura abierto (ORF) para tcdB es de 7.098 nucleótidos de longitud. Es importante mencionar que, además de los principales genes de toxinas en la región PaLoc, hay otros tres genes accesorios que codifican en la región PaLoc: tcdR (L), tcdC (R) y tcdE en el centro. Estos genes ayudan a regular la expresión de TcdA y TcdB. También ayudan a secretar o liberar las toxinas de la célula. El gen codificador tcdE, ubicado entre tcdB y TcdA, es análogo a las proteínas holinas, por lo que se sugiere que el tcdE funciona como un gen facilitador que mejora la liberación o secreción de TcdA y TcdB, lo que aumenta la permeabilidad de la membrana de la célula huésped.
Figura 2: Locus de Patogenicidad arquetípica (PaLoc), que codifica las toxinas clostridiales grandes(TCL) involucradas en C. infecciones difficiles CDI.
Detección de toxinasedItar
Hay diferentes tamaños de plásmidos de C. difficile. Los pesos moleculares detectados oscilan entre 2, 7×106 y 100×106, pero los tamaños de plásmidos no muestran correlación con la toxicidad. Para detectar el nivel de toxina B en C. difficile, los médicos usan ampliamente ensayos de cultivo celular derivados de muestras de heces de pacientes con PMC. El ensayo de cultivo celular se considera un «estándar de oro» para detectar toxicidad en C. difficile porque una pequeña cantidad de toxina B es capaz de causar el redondeo celular (Fig. 4), por lo tanto, es una gran ventaja de los laboratorios clínicos hacer correlaciones con la DAVD causada por la TcdB. Aunque se encontró actividad citotóxica de toxinas clostridiales grandes (TCLc) en muestras de heces de pacientes PMC, la actividad de la toxina B tuvo efectos citotóxicos más perjudiciales en comparación con la toxina A. Por lo tanto, la actividad de la toxina A se atenúa cuando no se aísla de la toxina B. La detección de la toxicidad de C. difficile es extremadamente sensible, sin embargo, el uso del ensayo de cultivo celular permite a los laboratorios clínicos superar el desafío; el uso de dosis tan pequeñas como 1 pg/ml de toxina B es suficiente para provocar el redondeo celular. Esta es la principal ventaja en el uso del ensayo de tejido de cultivo para detectar toxicidad en pacientes con CMP. A pesar de que los laboratorios clínicos han tratado de utilizar un ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA) y otras técnicas para detectar la actividad citotóxica de la toxina B en las heces de pacientes con CMP, los resultados no son tan precisos como aquellos en los que se utilizaron ensayos de cultivo celular.
Factor de producciónEditar
Añadiendo antimicrobianos, p. ej. la clindamicina, en el medio de cultivo, los estudios han demostrado que la actividad citotóxica en cultivos de C. difficile aumenta en 4-8 veces. Además, al conocer el papel de los antibióticos en las causas de las PMC, muchos estudios anteriores se centraron en los efectos de la producción de toxinas antimicrobianas. Como resultado, los estudios pudieron concluir que la naturaleza subinhibitoria de los niveles de vancomicina y penicilina estaba aumentando la producción de toxinas en cultivos de C. difficile. Las cantidades de producción de toxinas se correlacionaron con el uso de medio de crecimiento para los organismos. Otro estudio ilustró que los altos niveles de producción de toxinas de TcdB se observaron en medios complejos como el caldo de infusión del cerebro y el corazón. Se produjeron altos niveles de toxinas con aislamiento de altamente virulentas. Por el contrario, se produjeron bajos niveles de toxinas con el aislamiento de débilmente virulentas. Por lo tanto, muestra que las producciones de toxinas fueron correguladas. Aunque no se conoce el mecanismo detrás de la participación del medio ambiente en la modulación de las señales que expresan las toxinas, los estudios in vitro han demostrado que la expresión de toxinas se ve reforzada por la represión de catabolitos y el estrés, por ejemplo, los antibióticos. Otro estudio ha demostrado que la biotina limitante en un medio bien caracterizado aumenta la producción de TcdB en 64 veces y TcdA en 35 veces. Esto se hizo con C. difficile y dosis de biotina tan pequeñas como 0,05 nM. Varios otros estudios tempranos han argumentado en contra de la teoría de que la producción de toxinas tiene algo que ver con el estrés o la represión de catabolitos de las toxinas TcdA o TcdB. Además, muchos estudios dicen que la razón principal de las diferencias entre otros estudios se debe a que la producción de toxinas no ocurre con todos los aislados de C. difficile.