etablering af et konkurrencedygtigt Bindingsassay, der identificerer de forskellige egenskaber ved neutraliserende epitoper af Hepatitis E-Virus

abstrakt

mål: at bekræfte de forskellige egenskaber ved genotypespecifikke og almindelige neutraliserende epitoper af hepatitis E-virus (HEV). Metode: Der blev etableret et kompetitivt bindingsassay med kendte genotype-almindelige neutraliserende monoklonale antistoffer (mAbs) 3G1 og 5G5 samt genotype-specifikke neutraliserende mAbs 2B1 og 4C5. Hev ORF2 rekombinant p166v01 afledt af genotype 1 og p166Chn afledt af genotype 4 blev anvendt som coatede antigener til at bestemme, om MAB ‘ erne genkender uafhængige, lignende eller overlappende epitoper. MAB ‘ er blev produceret, renset og konjugeret med peberrodsperidase (HRP). HRP-konjugeret 2B1 kunne kun reagere med p166v01, men ikke p166Chn, HRP-konjugeret 4C5 kunne kun reagere med p166Chn, men ikke p166v01, mens HRP-konjugeret 3G1 og 5G5 kunne reagere både med p166v01 og p166Chn. Således blev konkurrencedygtige bindingsassays udført successivt under anvendelse af p166v01 og p166Chn antigen. Resultater og konklusion: resultaterne af konkurrencedygtige bindingsanalyser afslørede, at bindingen af HRP-konjugeret 2B1 til p166v01 ikke kunne hæmmes af 5G5 eller 3G1. Tilsvarende kunne bindingen af HRP-konjugeret 4C5 til p166Chn ikke hæmmes af 5G5 eller 3G1. Imidlertid blokerede mAbs 5G5 og 3G1 hinandens binding til p166v01 og p166Chn, hvilket antyder, at almindelige og genotypespecifikke neutraliserende MAB ‘ er genkender uafhængige epitoper.

Kurt 2018 S. Karger AG, Basel

introduktion

Hepatitis E-virus (HEV) er en ikke-indkapslet, positiv-streng RNA-virus, der overføres hovedsageligt gennem den orale vej og forårsager akut hepatitis E hos mennesker . HEV-infektion kan føre til skadelige prognostikere, for eksempel livssvigt, alvorlig akut hepatitis, kronisk infektion i det transplanterede organ og hos immunsupprimerede patienter og høj dødelighed hos gravide kvinder . Ud over bekræftet infektion hos mennesker inficerer HEV ‘ er også dyr og kan overføres fra dyr til mennesker; forekomsten af hepatitis E-infektion i de udviklede lande er også steget markant . Disse resultater tyder på, at HEV udgør en trussel mod folkesundheden over hele kloden .

selvom en serotype er blevet anerkendt, kunne hev-isolater, der stammer fra forskellige områder over hele verden, klassificeres i 4 hovedgenotyper . HEV ‘ er af genotype 1 og 2 adskiller sig fra genotype 3 og 4 i deres epidemiologiske, antigene og immunogene egenskaber .

hidtil er forskning i antigen epitopkarakterisering hovedsageligt baseret på hev-strukturproteinet til et in vitro-kultursystem ikke tilgængeligt . pORF2 er det vigtigste hev-strukturelle protein kodet af ORF2, som er 1 ud af 3 overlappende åbne læserammer (Orf ‘ er) af det virale genom . Overvejende immunogene regioner af pORF2 er blevet lokaliseret i C-terminal 2/3-regionen, som var de vigtigste mål for vaccineudvikling .

vores tidligere undersøgelse har afsløret eksistensen af en immunogenicitetsforskel mellem hepatitis E-vaccinen p179 (439-617 aminosyrer af ORF2-proteinet) afledt af genotype 4 og p239 (Hecolin) afledt af genotype 1, Forskellen kan tilskrives tilstedeværelsen af HEV-genotypespecifik epitop(er) . Monoklonale antistoffer (MAB ‘ er) produceret i mus immuniseret henholdsvis med p166Sar(452-617 aminosyrer af ORF2-proteinet) afledt af genotype 1 og p166Chn afledt af genotype 4 er blevet anvendt til at bekræfte tilstedeværelsen af ge notype-specifik epitop (er). Udover 2 genotype-almindelige neutraliserende MAB ‘er, 3G1 og 5G5, blev der også opnået 2 genotype-specifikke neutraliserende MAB’ er, 2B1 og 4C5. 2B1 mod p166Sar kunne specifikt binde til genotype 1 og 2 rekombinante proteiner og kun neutralisere genotype 1 og 2 stammer in vitro; 4C5 mod p166Chn immunoreageret specifikt mod genotyper 3 og 4 rekombinante proteiner og neutraliserede kun genotype 3 og 4 stammer, mens 3G1 mod p166Sar og 5G5 mod p166Chn kunne binde til genotyper 1-4 rekombinante proteiner og neutraliserede 4 genotypestammer . For yderligere undersøgelse af de forskellige egenskaber ved genotype-almindelige og genotype-specifikke neutraliserende epitoper af HEV blev der udviklet et konkurrencedygtigt bindingsassay ved hjælp af mAbs 2B1, 3G1, 4C5 og 5G5 for at bekræfte, om epitoper anerkendt af mAbs er uafhængige, lignende eller overlappende.

materialer og metoder

rekombinante proteiner

rekombinant p166 var et trunkeret protein af pORF2, nukleotidsekvenserne blev afledt af følgende hev-stammer: V01 (genotype 1, JKS857689) og China-9829 (genotype 4, AY789225). Rekombinante plasmider blev konstrueret og udtrykt i Escherichia coli . De 2 his-mærkede P166-proteiner blev betegnet som henholdsvis p166v01 og p166Chn.

Mab-produktion

i alt 4 neutraliserende MAB ‘ er, 2B1, 3G1, 4C5 og 5G5 beskrevet tidligere blev brugt til at udvikle et konkurrencedygtigt immunosorbentassay (ELISA). 2B1 og 3G1 blev rejst mod p166Sar; 4C5 og 5G5 blev rejst mod p166Chn . MAB ‘erne blev produceret ved at injicere 106 hybridomaceller i bukhulen i en BALB/c-mus; ascitesvæske indeholdende MAB’ er blev høstet efter 7-10 dage, filtreret, centrifugeret og opbevaret ved -80 liter C .

oprensning af mAbs

mAb ascitesvæsken blev oprenset ved anvendelse af protein G-sepharose kolonne affinitetskromatografi (Sigma, Tyskland). Fraktioner indeholdende antistof blev opsamlet under anvendelse af den sure elueringsbuffer (0,1 M glycin-HCl, pH 2,8) fra det immobiliserede protein G og derefter bestemt ved 280 nm; absorbans ved 280 nm (A280) kan bruges til groft at kvantificere MAB ‘ erne. Natriumdodecylsulfat polyacrylamidgelelektroforese blev anvendt til at bekræfte og kvantificere de oprensede fraktioner under anvendelse af bovint serumalbumin .

kobling af Peberrodsperoksidase til MAB ‘er

oprensede MAB’ er blev dialyseret mod 100 mM carbonat/bicarbonatbuffer (pH 9,3) ved 4 liter C natten over . Antistoffer blev koblet til peberrodsperidase (HRP) efter producentens anvisninger (KPL). Cirka 1,5 mg HRP blev blandet med 0,5 mg mAb i 0,5 mL total volumen HRP-konjugeringsbuffer ved forsigtigt omrøring ved stuetemperatur i 1 time. blandingen blev efterladt ved stuetemperatur i 15 minutter efter tilsætning af 10 liter af reduktionsmidlet, og derefter blev 1 volumen destilleret glycerol tilsat til opbevaring og videre anvendelse.

krydsreaktivitet af HRP-konjugerede MAB ‘er til heterolog P166-Antigen

ELISA-metoden blev anvendt til at bekræfte krydsreaktivitet af HRP-konjugerede MAB’ er med p166v01 og p166Chn-antigen . Kort fortalt blev brønde af mikroplader overtrukket med henholdsvis 100 ng af p166v01-og p166Chn-antigenet, inkuberet i 2 timer ved 37 liter C. Dette blev efterfulgt af fjernelse af overtrukne antigener; 200 liter phosphatbufret saltvand (PBS) indeholdende 0,1% bovint serumalbumin blev tilsat i brønde, og derefter blev mikroplader inkuberet ved stuetemperatur med mild omrystning. To timer senere blev blokeringsbufferen kasseret, og brøndene blev vasket to gange med PBS indeholdende 0,05% mellem-20 (PBST). Serielle 2 gange fortyndinger af HRP-konjugerede MAB ‘er i området fra 1: 400 til 1: 25.600 i 1% kasein PB’ er blev tilsat i tilsvarende brønde efterfulgt af 45 min inkubation ved 37 liter C; kasein PBS blev fjernet ved vask 5 gange med PBST. Flydende substrat blev tilsat til farveudvikling til inkubation ved 37 liter C i 10 min. Endelig blev den optiske densitet (OD) af hver brønd læst ved 450 nm med en 630 nm referencebølgelængde.

bestemmelse af Antigen-og mAb-titere

titrene af antigen og Mab ‘ er blev bestemt ved anvendelse af en ELISA. Oprindeligt blev serielle 2 gange fortyndinger af HRP-konjugerede MAB ‘er i området fra 1: 400 til 1: 25.600 i 1% kasein PB’ er fremstillet og derefter tilsat til brønde forbelagt med serielle fortyndinger af p166v01 eller p166Chn antigen. Efterfulgt af en inkubation på 45 minutter ved 37 liter C blev ubundne MAB ‘ er fjernet ved vask 5 gange med PBST. Flydende substrat blev tilsat til farveudvikling til en 10-min inkubation ved 37 liter C. Endelig blev OD for hver brønd læst ved 450 nm med en 630 nm referencebølgelængde for at bestemme den fortynding, der var undermættet og gav en OD-aflæsning på cirka 1,0 ved 450 nm med en 630 nm referencebølgelængde.

kompetitiv Bindingsassay

de forskellige karakteristika ved almindelige og genotype-specifikke neutraliserende epitoper af HEV blev undersøgt ved hjælp af et parvis kompetitiv bindingsassay etableret med common og genotype-specifik neutraliserende MAB ‘ er . Metoderne svarede til de ovenfor beskrevne procedurer, bortset fra at p166v01 og p166Chn blev anvendt som henholdsvis belægningsantigenet, og blandinger af HRP-konjugeret mAb ved to gange koncentrationen og en mættet koncentration af ukonjugeret mAb blev tilsat til de overtrukne brønde. OD blev målt ved 450 nm med en 630 nm referencebølgelængde. Den procentvise hæmning blev beregnet ved hjælp af formlen: 100 liter . Konkurrencen blev vurderet som positiv, hvis inhiberingsprocenten var mere end 50%.

resultater

krydsreaktivitet af HRP-konjugerede MAB ‘er til heterolog P166-Antigen

ELISA-metoden blev anvendt til at evaluere krydsreaktivitet af HRP-konjugerede MAB’ er til p166v01-og p166Chn-antigener. Resultaterne afslørede, at HRP-konjugeret 2B1 ved fortyndinger fra 1: 400 til 1: 25.600 kun reagerede med p166v01, men ikke med p166Chn, og HRP-konjugeret 4C5 ved fortyndinger fra 1: 400 til 1: 25.600 reagerede kun med p166Chn. I modsætning hertil reagerede HRP-konjugeret 3G1 og 5G5 ved fortyndinger fra 1: 400 til 1: 25.600 godt med de 2 P166 proteiner (Fig. 1). Disse observationer svarede til de tidligere fund, 2B1 og 4C5 er genotype-specifikke MAB ‘er, mens 3G1 og 5G5 er genotype-almindelige MAB’ er .

bestemmelse af P166v01-Antigen og HRP-konjugerede Mab-titere til den konkurrencedygtige Bindingsassay

p166v01-antigen blev anvendt til at bestemme den konkurrencedygtige bindingsassay af mAbs 2B1, 3G1 og 5G5; de korrekte titere af mAbs og antigen blev bestemt ved anvendelse af ELISA. Som vist i tabel 1, Efter kvadrattitrering, når fortyndingen af p166v01-antigenet var 1: 400, var HRP-konjugeret 2B1 1: 6.400, den gennemsnitlige OD-værdi var tæt på 1,0. I mellemtiden, som vist i tabel 2, Når fortyndingen af antigen var 1: 400, var HRP-konjugeret 5G5 og HRP-konjugeret 3G1 henholdsvis 1: 6.400 og 1: 12.800, og den gennemsnitlige OD-værdi var tæt på 1,0.

bestemmelse af P166chn-Antigen og HRP-konjugerede Mab-titere til den konkurrencedygtige Bindingsassay

p166Chn-antigen blev anvendt til at bestemme den konkurrencedygtige bindingsassay af mAbs 4C5, 3G1 og 5G5 blev de korrekte titere af mAbs og antigen også bestemt ved anvendelse af ELISA. Som vist i tabel 3, Efter firkantet titrering, når fortyndingen af p166Chn-antigenet var 1: 800, var HRP-konjugeret 4C5 1: 6.400, og den gennemsnitlige OD-værdi var tæt på 1,0. I mellemtiden, som vist i tabel 4, Når fortyndingen af antigenet var 1: 800, var fortyndingerne af HRP-konjugeret 5G5 og HRP-konjugeret 3G1 henholdsvis 1: 6.400 og 1: 12.800; den gennemsnitlige OD-værdi var tæt på 1,0.

inhibering af Binding af MAB ‘ er til p166v01

resultaterne af inhibering er vist i tabel 5; bindingen af HRP-konjugeret 2B1 til p166v01 antigen blev hæmmet af ukonjugeret 2B1 med 68% inhibering. Der var ingen signifikant hæmning mellem 2B1 med mAbs 5G5 og 3G1 (27 og 30%). Mere fuldstændig inhibering blev opnået fra heterologe MAB ‘ er 3G1 og 5G5, for bindingen af HRP-3G1 til antigen blev inhiberet af 5G5 med 61% inhibering, HRP-konjugeret 5G5 til antigen blev inhiberet af 3G1 med 99% inhibering. Binding af HRP-3G1 og HRP-5G5 til p166v01 antigen blev også næsten fuldstændigt hæmmet af sig selv (81 og 80% inhibering). Disse resultater tyder på, at 3G1 og 5G5 kan dele den samme epitop eller overlappende epitop, men 2B1 genkender sandsynligvis en anden epitop.

inhibering af Binding af MAB’ er til p166Chn

resultaterne af inhibering er vist i tabel 5: bindingen af HRP-4C5 til p166Chn blev hæmmet af ukonjugeret 4C5 med 69% inhibering, der var ingen signifikant inhibering (25 og 30%) opnået fra de andre 2 ukonjugerede MAB ‘ er 3G1 og 4C5. Imidlertid blev en højere inhiberingshastighed opnået fra HRP-konjugeret mAbs 3G1 og 5G5 binding til antigen, hæmmet af ukonjugeret 5G5 og 3G1 med 65 og 76% inhibering. Binding af HRP-konjugeret 3G1 og HRP-konjugeret 5G5 til p166Chn antigen blev også næsten hæmmet af sig selv. Disse resultater antyder også, at 3G1 og 5G5 kan dele den samme epitop eller overlappende epitop, mens 4C5 sandsynligvis genkender en anden epitop.

Diskussion

siden den nye svinehev først blev isoleret , er der rapporteret om anti-hev-antistoffer hos mange dyr, afsløret HEV-infektion blandt dyr og mennesker, og dette kan overføres fra dyr til mennesker . Reduktionen af hepatitis E morbiditet og dødelighed afhang af vaccineforebyggelse og effektiv diagnose. Kendskab til epitoper af HEV var afgørende for vaccineforberedelse og diagnostisk udvikling . Påvisning af specifikke antistoffer i serum er en af de vigtigste diagnostiske metoder, og der er et stigende antal serologiske assays til antistofdetektion. Imidlertid varierer analyserne, der bruges til at detektere specifikke antistoffer, betydeligt i følsomhed . Nogle kommercielle diagnostiske assays baseret på genotype 1 eller 2 antigener registrerer ikke serumantistoffer mod genotyper 3 eller 4 isolater . Der vides ikke meget om de mekanismer, der ligger til grund for ikke-korrespondancen mellem de forskellige diagnostiske assays.

på nuværende tidspunkt er et in vitro cellekultursystem stadig utilgængeligt for HEV-forskning. Derfor er pORF2 indeholdende de fleste immunogene steder blevet anvendt i vid udstrækning til hev-immunologisk undersøgelse med en konformationsafhængig karakter . Det strukturelle grundlag for et immunogen til at fremkalde neutraliserende og beskyttende antistoffer er den neutraliserende epitop, som er hovedmålet for udvikling af hepatitis E-vaccine . Vi har tidligere rapporteret, at P166-proteinet, et trunkeret protein af pORF2, kan modellere HEV-neutraliserende epitop(er), og antistoffer hævet mod p166 kunne krydsneutralisere forskellige genotyper af HEV . Derudover var hepatitis E p239-vaccine afledt af genotype 1 HEV effektiv i et klinisk fase 3-forsøg udført i Jiangsu-provinsen, Kina, hvor epidemisk hev-isolat er genotype 4 . Disse fund afslørede, at der findes almindelige neutraliserende epitoper inden for de forskellige genotyper af HEV. Udover den almindelige neutraliserende epitop(er) er genotype-Spe cific epitop (er) også blevet bekræftet at eksistere til MAB-forberedelse og karakterisering .

for yderligere at identificere karakteriseringen af almindelige og genotype-specifikke neutraliserende epitoper blev det konkurrencedygtige inhiberingsassay etableret med fælles neutraliserende MAB ‘er, 3G1 og 5G5 og genotype-specifikke neutraliserende MAB’ er, 2B1 og 4C5 for at undersøge konkurrencebindingen til p166v01 eller p166Chn antigen og for at afgøre, om MAB ‘ erne genkender uafhængige, lignende eller overlappende epitoper.

oprindeligt blev ascitiske væsker af mAbs 3G1, 2B1, 5G5 og 4C5 produceret, oprenset og konjugeret med HRP. ELISA-metoden blev anvendt til at sammenligne den bindende af-finitet af HRP-konjugerede MAB ‘ er med forskellige genotyper af HEV p166. Resultaterne viste, at HRP-konjugeret ed 2B1 kun reagerede med genotype 1 p166v01, men ikke p166Chn. Tilsvarende reagerede HRP-konjugeret 4C5 kun med p166Chn. I modsætning hertil reagerede HRP-konjugeret 3G1 og 5G5 godt mod de 2 genotype p166-proteiner. Så konkurrencedygtige bindingsassays er baseret på genotype 1 og 4 hev p166 antigener. Resultaterne af konkurrencebindende analyser er ikke overraskende, dvs. at bindingen af 2B1 til p166v01 kun konkurrerede af sig selv, mens 3G1 og 5G5 kunne konkurrere hinanden om bindingen til p166v01. Desuden blev bindingen af 4C5 til p166Chn ligeledes kun konkurreret af sig selv, men 3G1 og 5G5 kunne konkurrere hinanden om bindingen til p166Chn. Disse fund viste, at 3G1 og 5G5 genkender de samme eller overlappende epitoper, og at 2B1 og 4C5 genkender forskellige.

Dette er den første undersøgelse, der undersøger de forskellige egenskaber ved genotype-almindelige og genotype-specifikke konformationsneutraliserende epitoper af HEV. Vi demonstrerede, at almindelige og genotype-specifikke neutraliserende epitoper kan være uafhængige. Denne opdagelse er meget gavnlig for at demonstrere de mekanismer, der ligger til grund for den lave overensstemmelse mellem de forskellige diagnostiske assays. Yderligere undersøgelser er af afgørende betydning for at belyse de forskellige egenskaber ved neutraliserende epitoper af HEV i effektiviteten af diagnostisk udvikling og vaccinepræparation.

anerkendelse

Dette arbejde blev støttet af ph.d. – forskningsfonden for Anhui Medical University (No. 0110037101).

oplysningserklæring

forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

forfatter kontakter

artikel / offentliggørelse detaljer

Copyright / Drug dosering / Disclaimer

ophavsret: Alle rettigheder forbeholdes. Ingen del af denne publikation må oversættes til andre sprog, gengives eller bruges i nogen form eller på nogen måde, elektronisk eller mekanisk, inklusive fotokopiering, optagelse, mikrokopiering, eller ved ethvert informationslagrings-og hentningssystem, uden skriftlig tilladelse fra udgiveren.
lægemiddeldosering: forfatterne og udgiveren har gjort alt for at sikre, at lægemiddeludvælgelse og dosering, der er beskrevet i denne tekst, er i overensstemmelse med de nuværende anbefalinger og praksis på offentliggørelsestidspunktet. Imidlertid, i betragtning af igangværende forskning, ændringer i regeringens regler, og den konstante strøm af information vedrørende lægemiddelterapi og lægemiddelreaktioner, læseren opfordres til at kontrollere indlægssedlen for hvert lægemiddel for ændringer i indikationer og dosering og for tilføjede advarsler og forholdsregler. Dette er især vigtigt, når det anbefalede middel er et nyt og/eller sjældent anvendt lægemiddel.
ansvarsfraskrivelse: erklæringerne, udtalelserne og dataene i denne publikation er udelukkende de enkelte forfattere og bidragydere og ikke af udgiverne og redaktøren(e). Udseendet af reklamer eller/og produktreferencer i publikationen er ikke en garanti, godkendelse eller godkendelse af de annoncerede produkter eller tjenester eller af deres effektivitet, kvalitet eller sikkerhed. Udgiveren og redaktøren(e) fraskriver sig ansvaret for enhver skade på personer eller ejendom som følge af ideer, metoder, instruktioner eller produkter, der henvises til i indholdet eller reklamerne.