Bile-Esculin Test for Presumptively Identification of enterokokit ja streptokokit: Effects of Bile Concentration, Inoculation Technique, and Incubation Time

katalaasinegatiivisten, alfa-hemolyyttisten ja nonhemolyyttisten grampositiivisten kokcien tunnistaminen ja erilaistuminen pareittain ja ketjuin enterokokkeiksi, D-ryhmän streptokokkeiksi (mainlyStreptococcus bovis) ja D-ryhmän ulkopuolisiksi viridans-ryhmän streptokokkeiksi on kliinisesti tärkeää (10). Sappi-eskuliinitestiä käytetään laajalti erottamaan enterokokit ja D-ryhmän streptokokit, jotka ovat sappitolerantteja ja voivat hydrolysoida eskuliinin esculetiiniksi, D-ryhmän viridans-ryhmän streptokokit, jotka kasvavat huonosti sapessa. Ensimmäisen kerran Meyer ja Schonfeld (8) kuvasivat vuonna 1926, ja Facklam ja Moody (2, 3, 5) osoittivat sapen-eskuliinitestin herkkyyden olevan 100% ja spesifisyyden 97% enterokokkeja ja D-ryhmän streptokokkeja tunnistettaessa. Nämä tulokset saatiin agar vinot sisältävät 4% oxgall (sappisuolat), inokuloitu 1 tai 2 tippaa 24-h Todd-Hewitt molemmat viljelmä organismin (”seuraavan päivän” inokulaatio), ja inkuboidaan 48 h. rutiinidiagnostinen bakteriologia, tällainen protokolla on epäkäytännöllinen, koska se vaatii 3 päivää siitä, kun pesäkkeet havaitaan primaarilevyillä. Useimmat oppikirjat ja menettelykäsikirjat suosittelevat agar-vinojen inokulointia suoraan muutamasta pesäkkeestä (”saman päivän” inokulaatio) eikä 24h-alakulttuurista liemessä, mutta tätä ei-standardoitua vaihtoehtoista tekniikkaa tukevat tiedot puuttuvat.

siksi arvioimme sappi-eskuliinitestin herkkyyttä ja spesifisyyttä kahdella eri menetelmällä saman päivän inokulaatiolla (standardoitu ja ei-standardoitu) ja kahdella eri inkubaatioajalla (24 ja 48 h). Vertailimme myös 2-ja 4-prosenttista oxgallia sisältäviä esculin-vinoja formulaatioissa, joita on tällä hetkellä saatavilla kahdesta merkittävästä kaupallisesta lähteestä Yhdysvalloissa.

Katalaasinegatiiviset, grampositiiviset coccit pareittain ja ketjuina, jotka muodostavat alfa-hemolyyttisiä tai nonhemolyyttisiä pesäkkeitä 5%: n lampaanveriagarilla, jotka olivat positiivisia PYR: lle (Murex , Dartford, Yhdistynyt kuningaskunta) ja kasvoivat tryptisessä soijaliemessä, joka sisältää 6,5% NaCl: ää (Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, Md.) tunnistettiin enterokokkeiksi; ne erikoistuivat API Rapid Strep-järjestelmään (bioMérieux Vitek, Hazelwood, Mo.). Katalaasinegatiiviset, grampositiiviset coccit pareittain ja ketjuina, jotka muodostivat alfa-hemolyyttisiä tai nonhemolyyttisiä pesäkkeitä, jotka olivat negatiivisia PYR: lle, eivät kasvaneet 6, 5%: ssa NaCl: ää, olivat positiivisia ryhmän D antigeenille lateksiagglutinaatiolla (Murex) ja joilla oli viittaava (≥90%: n todennäköisyys) biokemiallinen kuvio API: n nopean Streptokokkijärjestelmän avulla tunnistettiin nimellä S. bovis. Katalaasinegatiivisia, grampositiivisia kocceja pareittain ja ketjuina, jotka muodostivat alfa-hemolyyttisiä tai nonhemolyyttisiä pesäkkeitä, jotka olivat negatiivisia PYR-ja D-ryhmän antigeeneille (ja jotka olivat alfahemolyyttisessä tapauksessa sappeen liukenemattomia), kutsuttiin viridans-ryhmän streptokokkeiksi.

testattiin yhteensä 110 enterokokkikantaa (34 Enterococcus faecalis-kantaa, 15 Enterococcus faecium-kantaa ja 61 nonhemolyyttistä ja määrittelemätöntä kantaa), 30 S. bovis-kantaa (2 alfa-hemolyyttistä ja 28 ei-hemolyyttistä kantaa) ja 110 D-ryhmän viridans-ryhmän streptokokkikantaa (83 alfa-hemolyyttistä ja 27 ei-hemolyyttistä kantaa). Kannat eristettiin peräkkäin veriviljelmistä, jotka suoritettiin Duke University Medical Centerissä 4 vuoden aikana, lukuun ottamatta 19 S. bovisstrainia, jotka saatiin Mayo-klinikalta.

tuoreita (24-h) bakteereita inokuloitiin kolmeen eri esculin agar-linjaan, jotka sisälsivät joko ilman sapea (BDMS), 2% oksgallia (vastaa 20% sappea) (BDMS) tai 4% oksgallia (vastaa 40% sappea) (Remel, Lenexa, Kans.). Oxgallia lukuun ottamatta kolmen median sävellykset olivat samat. Kussakin väliaineessa käytettiin seuraavia kahta inokulaatiotekniikkaa: I) suora, ei-standardoitu S-muotoinen inokulaatio 1-10 pesäkkeestä ja ii) epäsuora, standardoitu inokulaatio 10 µl (kalibroitu silmukka) 0, 5 McFarlandin standardisuspensiolla steriiliin deionisoituun veteen. Vinoja inkuboitiin 35°C: n lämpötilassa ilmassa (2) irtokarkkien kanssa 48 tunnin ajan. lukemat otettiin 24 ja 48 tunnin kohdalla. reaktiota pidettiin positiivisena, kun vähintään puolet väliaineesta mustui (4).

yhtä poikkeusta lukuun ottamatta kaikki 110 enterokokkikantaa antoivat selviä positiivisia reaktioita 24 ja 48 tunnin inkubaation jälkeen (99% herkkyys). Standardoitu inokulaatti (noin 106 PMY) oli yhtä herkkä kuin raskaampi, ei-standardoitu inokulaatti. Facklam ja Moody, jotka käyttivät 107-108 PMY: n inokulaattia agar-vinoihin, ilmoittivat herkkyyden olevan 100% 48 tunnin kohdalla, mutta havaitsivat 2 76 (5) ja 6 157 (3) enterokokkikannasta olevan sappi-eskuliininegatiivisia (98% herkkyys) 24 tunnin inkubaation jälkeen. Swan (13) sai 24 tunnin kohdalla 100%: n herkkyyden 121 enterokokkikannalla, kun käytettiin standardoimatonta inokulaattia, jota kuvailtiin painavaksi, sekä agar-levyjä, joissa mahdollinen mustuminen katsottiin positiiviseksi tulokseksi. Facklamin julkaisujen perusteella useimmat oppikirjat ja menettelyoppaat suosittelevat kuitenkin 48 tunnin inkubointia ennen negatiivisen tuloksen ilmoittamista.

kaikki 30 S. bovis-kantaa olivat positiivisia 24 ja 48 tunnin kohdalla riippumatta sappipitoisuudesta tai inokulointitavasta (100% herkkyys). Facklam (3) ilmoitti 37 D-ryhmän streptokokkikannan herkkyyden olevan 94% 24 tunnin kohdalla ja 100% 48 tunnin kohdalla.

taulukossa 1 esitetään väärien positiivisten sappi-eskuliinitestien prosenttiosuudet 110 d-ryhmään kuulumattoman viridans-ryhmän streptokokkikannan osalta. Havaitsimme, että spesifisyys (100% miinus prosentti vääriä positiivisia) oli maksimaalinen (97%) standardoidulla inokulaatilla, joka oli viiritetty agar-vinoihin, jotka sisälsivät 4% oxgallia ja luettiin 24 tunnin kuluttua. vääriä positiivisia saatiin kahdella Streptococcus millerija yhdellä Streptococcus lactis subsp: llä. diasetylaktisstreenit. Inokulaatin standardoimattomuus, oxgall-pitoisuuden lasku 2%: iin ja inkubaatioajan pidentäminen 48 h: iin nostivat väärien positiivien määrän enintään 24%: iin. Aiemmissa tutkimuksissa selektiivisellä eskuliini-agarilla, joka sisältää natriumatsidia ja vain 10% sappinestettä, positiiviset reaktiot D-ryhmän viridans-ryhmän streptokokkien kanssa olivat yleisiä (6, 11, 12). Tietoja 2% oksgallia sisältävän väliaineen käytöstä ei ole aiemmin julkaistu. Tuloksemme viittaavat siihen, että tämä pitoisuus on suboptimaalinen. Käyttämällä 4% oxgallia Swan (13) löysi 21 isolaatista kaksi sappitoleranttista viridans-ryhmän streptokokkikantaa; kumpikaan kanta ei kuitenkaan hydrolysoinut eskuliinia 24 tunnissa. Facklam et al. raportoidut erityisominaisuudet olivat 99% 24 tunnin (3) kohdalla ja 81 (4) – 97% (3) 48 tunnin kohdalla ja 4% oxgallilla.

silmiinpistävä ero havaittiin, kun alfahemolyyttisten ja nonhemolyyttisten Ei-D-ryhmän viridans-ryhmän streptokokkien alaryhmiä verrattiin väärien positiivisten määrien osalta. Alfahemolyyttisillä kannoilla luku oli 0% 24 tunnin kuluttua ja 3% 48 tunnin kuluttua, kun taas ei-hemolyyttisillä kannoilla se oli 11% 24 tunnin kuluttua ja 33% 48 tunnin kuluttua, 4% oxgallilla ja standardoidulla inokulaatilla (P = 0, 017 24 tunnin arvoilla; kaksihäntäisen Fisherin tarkka testi). Tällaista havaintoa ei ole aiemmin raportoitu.

muista näytteistä kuin verestä ja normaalisti steriileistä paikoista enterokokkien luotettavaan tunnistamiseen riittää sappi-eskuliinikokeeseen perustuva vuokaavio yhdistettynä 6, 5%: n NaCl-toleranssiin tai PYR-pitoisuuteen. Veren ja normaalisti steriilien kohtien sappi-eskuliinipositiiviset organismit on määritettävä. Enterokokkien lajiutuminen on hyödyllistä epidemiologisista syistä ja koska E. faecium ja muut lajit ovat yleensä vastustuskykyisempiä antibiooteille kuin E. faecalis (8, 9). Lopullinen tunnistus. bovis on tärkeä, koska organismi liittyy paksusuolen karsinoomaan, joka on suljettava pois tällaisilta potilailta (7). Toisaalta väärät positiiviset ilmoitukset ofS: stä. bovis voi johtaa turhiin tutkimuksiin. Sappi-eskuliinipositiivisten organismien lajiutuminen mahdollistaa myös väärien positiivisten D-ryhmän viridans-ryhmän streptokokkien havaitsemisen. Hoitovirheitä voi esiintyä, jos streptokokit ja enterokokit tunnistetaan väärin (1). Sappi-eskuliininegatiivisten organismien rutiininomainen lajiutuminen ei ole tarpeen, koska enterokokit ja D-ryhmän streptokokit aiheuttavat harvoin vääriä negatiivisia reaktioita.

yhteenvetona voidaan todeta, että sappi-eskuliinitesti toimii hyvin, jotta enterokokit ja D-ryhmän streptokokit voidaan erottaa nopeasti muista kuin D-ryhmän viridans-ryhmän streptokokit helposti ja herkästi (>99%) ja spesifisesti (97%) edellyttäen, että se tehdään 40% sappea sisältävillä agar-vinoilla, jotka on tehty standardoidulla inokulaatilla (10 µl 0, 5 McFarlandin standardibakteerisuspensiolla) ja luetaan 24 tunnin kuluttua..