Clostridium difficile-toksiini B

kun glukosyylitransferaasin katalyyttinen treoniinijäämä deaktivoi pienten Gtpaasien perheen, esim.Rho: n perheen; Rac: n ja Cdc42: n kohdesolujen sisällä häiritsevät signaalin transduktiomekanismeja, mikä johtaa aktiinin sytoskeletonin, solun ja solun välisen liitoksen ja apoptoosin toimintahäiriöihin (Kuva. 5). Rho indusoi aktiinin stressikuitujen toimintaa. Rac-proteiinit säätelevät kalvorauhasten ja NADPH-oksidaasi neutrofiilien toimintaa. Cdc42 säätelee F-aktiinifilamentin muodostumista filopodiassa.

Sytotoksisuusedit

useat tutkimukset ovat osoittaneet, että tcdb: n esiintyminen nisäkässoluissa johtaa nopeisiin muutoksiin solujen morfologiassa ja solujen signaloinnissa. Lyhyessä ajassa solut näyttävät plakkia pienillä annoksilla TcdB: tä ja TcdA: ta. Lisäksi solujen kuolema on näiden toksiinien merkittävä vaikutus, kun solut ovat päihtyneet. Donta et al., toimitti eteenpäin, että TcdB: llä on vakavia vaikutuksia muissa nisäkässoluissa, kuten kiinanhamsterin munasarjasoluissa, ihmisen kohdunkaulan epiteelisoluissa, hiiren lisämunuaissoluissa, rotan hepatosyyteissä ja rotan astrosyyteissä (Kuva.3).

sytotoksisuus perustuu solutyyppeihin, jotka voivat olla 4-200-kertaisia. Yleensä tcdb: n infektoituessa solut menettävät rakenteellisen eheytensä lisäksi myös F-aktiinifilamenttien vähenemisen. Solujen kiertäminen tcdb: llä kestää enintään 2 tuntia (Kuva. 4), Mutta sikäli kuin solukuolema menee, se voi kestää noin 24 tuntia. Clostridium difficile-ripulin (CDAD) osalta sytopatismin vaikutukset ovat kriittisempiä kuin varsinainen solukuolema, koska kun solut menettävät sytoskeletonin aktiinifilamentin eheyden, ne menettävät myös normaalin toimintansa.

vaikutukset pieniin GTPasesEdit

tcdb: n sytotoksisen toiminnan syy isäntäsolussa välittyy pääasiassa reseptorin endosytoosin kautta. Happamien endosomien avulla toksiini B pääsee sytosoliin. Ilmiö tapahtuu sitoutuvan reseptorin alueella, jonka kautta toksiini pääsee isäntäsoluihin. Käyttämällä isäntäsolujen sytosolia tcdb deaktivoi pienet Gtpaasit (Kuva. 5), esim.Rho-suvun jäsenet Rac ja Cdc42 glykosyloimalla treoniini 35: n cdc42: ssa ja Rac: ssa ja treoniini 37: n Rho: ssa. Näitä Rho Gtpaaseja esiintyy kaikkialla eukaryoottisten solujen sytosolissa, jotka ovat vastuussa aktiinin tukirangan järjestämisestä, koska sytosolissa olevat toksiinit aiheuttavat aktiinifilamenttien tiivistymistä solujen pyöristämisen ja kalvon blebbauksen seurauksena (kuva. 3), joka lopulta johtaa apoptoosiin. TcdB aiheuttaa kriittisiä muutoksia solujen dynamiikkaan ja morfologiaan. Kuvassa 3 esitetään toksiinin B todennäköinen vaikutus solun pintaan; membrane blebbing (mustat nuolet). Lisäksi TcdB inaktivoi Rho Gtpaaseja. Tämän seurauksena solujen ja solujen liitokset häiriintyvät, mikä parantaa toksiinin B epiteelin läpäisevyyttä ja nesteen kertymistä lumeniin. Tämä on yksi tärkeimmistä aiheuttavista tekijöistä Clostridium difficile-liittyvän ripulin (CDAD)(Kuva. 5).

lisäksi UDP-glukoosin hydrolyysinopeus TCDB: ssä on noin viisi kertaa suurempi kuin TcdA: ssa. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että Rho: lla on translationaalinen modifikaatio prenylaation ja karboksimetylaation kautta, joka tapahtuu plasman solukalvon sytoplasmapuolella, eli GTP: n vaihto BKT: hen. Kun TcdB sitoutuu Rho: han ja muihin pieniin Gtpaaseihin, GTP hydrolysoituu BKT: ksi, mikä johtaa GTP: hen sidottuun (aktiiviseen) BKT: hen sidottuun (inaktiiviseen) (Kuva. 5). Lisäksi tätä vaihtoaktiivisuutta säätelevät solun sytosolissa olevat guaniinitekijät.

Signaalipolun häiriöt edit

Rho: n, Rac: n ja Cdc42: n solusäätelyllä on vaikutuksia sytoskeletonin aktiinifilamenttien läheisyydessä (Kuva. 4), nämä pienet Gtpaasit sisällytetään solusykliin, joka säätelee signaaleja mitogeeniaktivoitujen proteiinikinaasikinaasien (MAPKKs) kautta. Jotkin solujen fysiologiset osat, jotka eivät ole mukana aktiinifilamenteissa, eivät välttämättä aiheuta solujen pyöristymistä tai solukuolemaa heti, mutta loppupään reitin toiminta voi johtaa aktiinifilamenttien heikkenemiseen ja lopulta solukuolemaan.

vuonna 1993 tehdyssä tutkimuksessa Shoshan et al., osoitti, että tcdb: llä varustetut solut muuttivat fosfolipaasi A2: n aktiivisuutta. Tämä oli riippumaton tapahtuma aktiinin tukirangan katkeamisesta. Shoshan ym., osoitti myös, että TcdB esti reseptorin signalointitoimintaa deaktivoimalla Rho-proteiinit fosfolipaasi D: n kautta.

Huokosformaatioedit

TcdB pääsee solun sisäosiin klatriinivälitteisen endosytoosin kautta, kun toksiini B on osa sytosolia, glukosyylitransferaasi läpäisee endosomaalisen kalvon, joka laskee pH: ta, indusoi translokaation ja johtaa lopulta translokaatioalueen jäämien morfologisiin muutoksiin (958-1130). Hydrofobiset alueet iskostuvat isäntäkalvoon muodostaen huokosia,joiden läpi glukosyylitransferaasidomeenit pääsevät. Kun solut infektoituvat tcdb: stä happamassa ympäristössä, se vaimentaa myrkkyjä ja aiheuttaa muodon uudelleenjärjestelyjä (Kuva. 6). Happaman pH: n seurauksena tcdb: ssä on selviä eroja tryptofaanin alkuperäisessä fluoresenssissa, proteaasien herkkyydessä ja hydrofobisissa pinnoissa. Toinen ryhmä on osoittanut, että happamoituminen johtaa toksiinin konformaatiomuutoksiin ja, mikä tärkeintä, auttaa muodostamaan huokosia. Putatiivinen translokaatioalue (Kuva. 2) koostuu noin 801-1400 aminohaposta, joista jäämät 958-1130 ovat hydrofobisia ja vastaavat transmembraanihuokosten muodostumisesta. Suurin osa tutkimuksista käytti tcdb: n kantaa 630 osoittamaan C. difficile-toksiinien huokosenmuodostusaktiivisuutta.

indusoi pHEdit

selvittääkseen, tapahtuuko tcdb: n proteolyyttisen pilkkoutumisen vaikutuksia solun pinnalla tai happamissa endosomeissa, tutkimuksissa käytettiin bafilomysiini A1: tä, jonka tiedetään salpaavan endosomien V-tyypin H+-Atpaaseja. Tämä vähentää endosomien happamuutta. Tcdb: n fysiologinen kertymäreitti estää tcdb: n sytopaattisen aktiivisuuden. Kun solut olivat happamissa olosuhteissa (pH 4,0) 5 minuuttia sen jälkeen, kun TcdB oli sitoutunut solun pintaan 37 celsiusasteessa, havaittiin muodon uudelleenjärjestelyjä ja pyöristymistä. Kun pyöristettyjä soluja inkuboitiin vielä tunnin ajan neutraalissa pH: ssa (7.0) samanlaisin parametrein, solujen pyöristymistä ei kuitenkaan havaittu. Molemmat tutkimukset osoittivat, että toksiini B: llä on proteolyyttisen pilkkoutumisen ominaisuus, joka on kriittinen sytosolin pääsylle. Happaman endosomin pH johtaa tcdb: n topologisiin muutoksiin (kuva 6).

GeneticsEdit

tcdb-proteiinia koodaava geeni, tcdB, sijaitsee 19,6 kb: n kromosomialueella. Tätä kutsutaan patogeenisuuden lokukseksi tai Palociksi (kuva 2). Tcdb: n avoimen lukukehyksen (ORF) pituus on 7 098 nukleotidia. On tärkeää mainita, että palocin alueen tärkeimpien toksiinigeenien lisäksi on kolme muuta lisätoksiinigeeniä, jotka koodaavat palocin alueella.: tcdr (L), tcdc (R) ja tcde keskellä. Nämä geenit auttavat säätelemään TcdA: n ja TcdB: n ilmentymistä. Ne myös auttavat erittämään tai vapauttamaan myrkkyjä solusta. Koodaava geeni tcdE, joka sijaitsee tcdb: n ja tcdA: n välissä, on analoginen holiiniproteiinien kanssa, joten on ehdotettu, että tcdE toimii fasilitaattorigeeninä, joka tehostaa tcda: n ja TcdB: n vapautumista tai eritystä ja lisää näin isäntäsolukalvon läpäisevyyttä.

toksiini detectionsedit

C. difficile-bakteerin plasmidikokoja on erilaisia. Havaitut molekyylipainot vaihtelevat välillä 2, 7×106-100×106, mutta plasmidikoot eivät korreloi myrkyllisyyden kanssa. Jotta voidaan havaita toksiinin B taso C. difficile, kliinikot käyttävät laajasti soluviljelmä määritykset johdettu jakkara näytteitä potilailla, joilla on PMC. Soluviljelmämääritystä pidetään ”kultakantana” myrkyllisyyden toteamiseksi C. difficile-bakteerissa, koska pieni määrä toksiinia B voi aiheuttaa solujen pyöristymistä (Kuva. 4), siten, se on merkittävä etu kliinisten laboratorioiden tehdä korrelaatioita CDAD aiheuttama TcdB. Vaikka suurten clostridial-toksiinien (LCTs) sytotoksinen aktiivisuus havaittiin PMC-potilaiden ulostenäytteissä, toksiini B: n aktiivisuudella oli haitallisempia sytotoksisia vaikutuksia verrattuna toksiiniin A. siksi toksiini A: n aktiivisuus heikkenee, kun sitä ei ole eristetty toksiinista B. C: n difficile-toksisuuden osoittaminen on erittäin herkkä, kuitenkin käyttämällä soluviljelmäkoetta kliiniset laboratoriot voivat voittaa haasteen; niinkin Pienten annosten kuin 1 pg/mL toksiinia B riittää aiheuttamaan solujen pyöristymistä. Tämä on tärkein etu käytettäessä viljelmäkudosmääritystä toksisuuden osoittamiseen PMC-potilailla. Vaikka kliiniset laboratoriot ovat yrittäneet käyttää määritystä microtiter plate entsyymi-immunosorbent assay (ELISA) ja muita tekniikoita havaitsemaan toksiini B: n sytotoksisen aktiivisuuden PMC-potilaiden ulosteessa, tulokset eivät ole yhtä tarkkoja kuin ne, joissa käytettiin soluviljelmäkokeita.

tuotantotiedot

lisäämällä mikrobilääkkeitä, esim. klindamysiini, osaksi kulttuurin kasvualustan, tutkimukset ovat osoittaneet, että sytotoksinen aktiivisuus C. difficile viljelmissä kasvaa 4-8 kertaa. Lisäksi tietäen rooli antibioottien syitä PMC, monet aiemmat tutkimukset keskittyivät vaikutuksia mikrobilääkkeiden tuotannon myrkkyjä. Tämän seurauksena, tutkimukset pystyivät päättelemään, että subinhibitorinen luonne vankomysiini ja penisilliini tasot olivat lisäämällä toksiinin tuotantoa viljelmissä C. difficile. Toksiinin tuotantomäärät korreloivat eliöiden kasvualustan käytön kanssa. Toinen tutkimus osoitti, että tcdb: n korkea toksiinituotanto havaittiin monimutkaisissa medioissa, kuten aivojen ja sydämen infuusioliemessä. Korkeita myrkkypitoisuuksia tuotettiin eristämällä erittäin virulentteja. Vastaavasti, alhainen toksiineja tuotettiin eristämällä heikosti virulentti. Näin ollen se osoittaa, että myrkkytuotantoa säänneltiin yhdessä. Vaikka mekanismia, jolla ympäristö osallistuu toksiineja ilmaisevien signaalien modulointiin, ei ymmärretä, in vitro-tutkimukset ovat osoittaneet, että toksiinin ilmentymistä vahvistaa kataboliittisukellus ja stressi, esimerkiksi antibiootit. Toinen tutkimus on osoittanut, että biotiinin rajoittaminen hyvin luonnehditussa väliaineessa lisää TcdB: n tuotantoa 64-kertaiseksi ja TcdA: n 35-kertaiseksi. Tämä tehtiin C. difficile ja annokset biotiinia niinkin pieni kuin 0,05 nM. Useat muut varhaiset tutkimukset ovat vastustaneet teoriaa, jonka mukaan toksiinin tuotannolla olisi mitään tekemistä stressin tai joko toksiinin TcdA: n tai TcdB: n kataboliittien torjunnan kanssa. Myös monet tutkimukset sanovat tärkein syy eroja muiden tutkimusten johtuu toksiinin tuotantoa ei esiinny kaikkien isolaattien C. difficile.