competitive Binding Assay Identifying the Different Characteristics of Hepatitis E Virus

Abstract

Aims: to confirm the different characteristics of genotyyppi-specific and common neutralizing epitopes of hepatiitti E virus (HEV). Menetelmä: Kompetitiivinen sitoutumiskoe vahvistettiin tunnetuilla genotyypin yleisillä neutraloivilla monoklonaalisilla vasta-aineilla (mabs) 3G1 ja 5g5 sekä genotyypin spesifisillä neutraloivilla mabs 2B1 ja 4C5: llä. Päällystettyinä antigeeneinä käytettiin genotyypistä 1 peräisin olevaa HEV ORF2-rekombinanttia P166W01: tä ja genotyypistä 4 peräisin olevaa P166CHN: ää sen määrittämiseksi, tunnistavatko mAbs: t toisistaan riippumattomat, samankaltaiset tai päällekkäiset epitoopit. mabeja valmistettiin, puhdistettiin ja konjugoitiin piparjuuriperoksidaasilla (HRP). HRP-konjugoitu 2B1 pystyi reagoimaan vain p166w01: n, mutta ei p166Chn: n kanssa, HRP-konjugoitu 4C5 pystyi reagoimaan vain p166Chn: n, mutta ei p166W01: n kanssa, kun taas HRP-konjugoitu 3G1 ja 5G5 pystyivät reagoimaan sekä p166w01: n että p166chn: n kanssa. Näin ollen kompetitiiviset sidontakokeet suoritettiin peräkkäin käyttäen p166w01-ja p166chn-antigeenia. Tulokset ja johtopäätös: kilpailullisten sitomismääritysten tulokset osoittivat, että 5G5 tai 3g1 ei voinut estää HRP-konjugoidun 2B1: n sitoutumista p166w01: een. Vastaavasti HRP-konjugoidun 4C5: n sitoutumista p166Chn: ään ei voitu estää 5g5: llä tai 3G1: llä. Mabs 5G5 ja 3g1 kuitenkin estivät toistensa sitoutumisen p166W01: een ja p166Chn: ään, mikä viittaa siihen, että tavalliset ja genotyyppikohtaiset neutraloivat mAbs: t tunnistavat toisistaan riippumattomat epitoopit.

© 2018 S. Karger AG, Basel

Johdanto

hepatiitti E-virus (HEV) on kehittymätön, positiivisjuosteinen RNA-virus, joka tarttuu pääasiassa suun kautta ja aiheuttaa ihmiselle akuutin hepatiitti E: n . HEV-infektio voi johtaa haitallisiin ennusteisiin, kuten elämän vajaatoimintaan, vaikeaan akuuttiin hepatiittiin, elinsiirtopotilaiden ja immunosuppressiopotilaiden krooniseen infektioon sekä korkeaan kuolleisuuteen raskaana olevilla naisilla . Ihmisillä todettujen tartuntojen lisäksi HEVs tarttuu myös eläimiin ja voi tarttua eläimistä ihmisiin; myös e-hepatiittitartunnan esiintyvyys on lisääntynyt kehittyneissä maissa merkittävästi . Nämä havainnot osoittavat, että HEV aiheuttaa kansanterveydellisen uhan kaikkialla maailmassa .

vaikka yksi serotyyppi on tunnistettu, eri alueilta eri puolilta maailmaa peräisin olevat HEV-isolaatit voidaan luokitella 4 päägenotyyppiin . Genotyyppien 1 ja 2 hevoseläimet eroavat genotyypeistä 3 ja 4 epidemiologisilta, antigeenisiltä ja immunogeenisilta ominaisuuksiltaan .

tähänastista tutkimusta antigeenisestä epitooppien karakterisoinnista, joka perustuu pääasiassa HEV-rakenneproteiiniin in vitro-viljelyjärjestelmässä, ei ole saatavilla . pORF2 on tärkein ORF2: n koodaama HEV-rakenneproteiini, joka on 1 kolmesta viruksen perimän päällekkäisestä avoimesta lukukehyksestä (ORFs). Porf2: n pääasialliset immunogeeniset alueet on paikallistettu C-terminaalin 2/3 alueelle, jotka olivat rokotteen kehittämisen pääkohteita .

edellinen tutkimuksemme on paljastanut immunogeenisuuseron genotyypistä 4 peräisin olevan hepatiitti E-rokotteen p179 (439-617 ORF2-proteiinin aminohappoa) ja genotyypistä 1 peräisin olevan P239-rokotteen (Hekoliini) välillä, eron voidaan katsoa johtuvan HEV-genotyypille spesifisten epitooppien esiintymisestä . Monoklonaalisia vasta-aineita (mabs), joita on tuotettu genotyypistä 1 peräisin olevalla p166sar-valmisteella (452-617 ORF2-proteiinin aminohappoa) ja genotyypistä 4 peräisin olevalla p166chn-Valmisteella, on käytetty vahvistamaan GE-tyyppispesifisten epitooppien esiintyminen. Lisäksi saatiin 2 genotyyppikohtaista neutraloivaa MAB: tä, 3G1 ja 5g5, 2 genotyyppikohtaista neutraloivaa MAB: tä, 2B1 ja 4C5. 2B1 p166sar voi sitoutua genotyyppien 1 ja 2 rekombinanttiproteiineihin ja neutralisoida vain genotyyppien 1 ja 2 kantoja in vitro; 4C5 p166chn: ää vastaan immunoreaktioitui erityisesti genotyypin 3 ja 4 rekombinanttiproteiineja vastaan ja neutralisoi vain genotyypin 3 ja 4 kantoja, kun taas 3G1 p166sar: ia vastaan ja 5G5 p166Chn: ää vastaan saattoi sitoutua genotyypin 1-4 rekombinanttiproteiineihin ja neutralisoi 4 genotyypin kantaa . Genotyyppien yleisten ja genotyyppispesifisten neutraloivien HEV-epitooppien eri ominaisuuksien tarkempaa tutkimista varten kehitettiin kompetitiivinen sidontakoe mabs 2B1: n, 3G1: n, 4C5: n ja 5g5: n avulla sen varmistamiseksi, ovatko mabs: n tunnistamat epitoopit itsenäisiä, samankaltaisia vai päällekkäisiä.

materiaalit ja menetelmät

Rekombinanttiproteiinit

rekombinantti p166 oli porf2: n typistetty proteiini, nukleotidisekvenssit johdettiin seuraavista HEV-kannoista: W01 (genotyyppi 1, JX857689) ja China-9829 (genotyyppi 4, AY789225). Rekombinantit plasmidit rakennettiin ja ilmaistiin Escherichia Colina . 2 His-merkittyä p166-proteiinia nimettiin p166w01: ksi ja p166Chn: ksi.

Mab-tuotanto

yhteensä 4 aiemmin kuvattua neutraloivaa MAB: tä, 2B1, 3G1, 4C5 ja 5g5, käytettiin kilpailukykyisen entsyymi-immunosorbenttimäärityksen (ELISA) kehittämiseen. 2B1 ja 3g1 nostettiin p166saria vastaan; 4C5 ja 5g5 nostettiin p166chniä vastaan . MAbs tuotettiin ruiskuttamalla 106 hybridoomasolua BALB/c-hiiren vatsakalvononteloon; mabeja sisältävä askites-neste kerättiin 7-10 päivän kuluttua, suodatettiin, sentrifugoitiin ja varastoitiin -80°C: n lämpötilaan .

Mabs

Mab askites-neste puhdistettiin proteiini g-sefaroosikolonnin affiniteettikromatografialla (Sigma, Saksa). Vasta-ainetta sisältävät fraktiot kerättiin immobilisoidusta proteiinista g happamalla eluutiopuskurilla (0, 1 M glysiini-HCl, pH 2, 8) ja määritettiin sitten 280 nm: ssä; absorbanssia 280 nm: ssä (A280) voidaan käyttää mabs: n karkeasti kvantifioimiseen. Natriumdodekyylisulfaattipolyakryyliamidigeelielektroforeesilla varmistettiin ja kvantifioitiin puhdistetut fraktiot naudan seerumin albumiinilla .

Piparjuuriperoksidaasin liittäminen mabs: ään

puhdistetut mAbs: t dialysoitiin 100 mM karbonaatti/bikarbonaattipuskuria (pH 9,3) vasten 4°C: ssa yön yli . Vasta-aineet yhdistettiin piparjuuriperoksidaasiin (HRP) valmistajan ohjeiden (KPL) mukaan. Noin 1, 5 mg HRP: tä sekoitettiin 0, 5 mg: aan mAb: tä 0, 5 mL: aan HRP: n konjugaatiopuskuria sekoittamalla varovasti huoneenlämmössä 1 tunnin ajan. seos jätettiin huoneenlämpöön 15 minuutiksi sen jälkeen, kun siihen oli lisätty 10 µl pelkistintä, ja sitten 1 tilavuus tislattua glyserolia lisättiin säilytystä ja jatkokäyttöä varten.

HRP-konjugoidun mabsin ristireaktiivisuus Heterologiseen p166-antigeeniin

ELISA-menetelmää käytettiin vahvistamaan HRP-konjugoidun mabsin ristireaktiivisuus p166w01-ja p166chn-antigeenin kanssa . Mikrolaattikuopat päällystettiin lyhyesti 100 ng: llä p166w01-ja p166chn-antigeenia, joita inkuboitiin 2 tunnin ajan 37°C: ssa.tämän jälkeen pinnoitetut antigeenit poistettiin; kuoppiin lisättiin 200 µL fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS), joka sisältää 0, 1% naudan seerumin albumiinia, ja mikrolaatteja inkuboitiin huoneenlämmössä kevyesti ravistellen. Kaksi tuntia myöhemmin estopuskuri hävitettiin ja kaivot pestiin kahdesti PBS: llä, joka sisälsi 0, 05% Tween-20: tä (Pbst). Vastaaviin kuoppiin lisättiin HRP-konjugoidun MAB: n 2-kertaiset sarjalaimennokset 1: 400-1: 25 600 1-prosenttisessa kaseiini PBS: ssä, minkä jälkeen inkuboitiin 45 minuuttia 37°C: ssa; kaseiini PBS poistettiin pesemällä 5 kertaa PBST: llä. Värikehitystä varten lisättiin tetrametyylibentsidiininestesubstraattia inkubaatiota varten 37°C: ssa 10 minuutin ajan. Lopuksi kunkin kaivon optinen tiheys (OD) luettiin 450 nm: ssä, jossa on 630 nm: n viiteaallonpituus.

antigeeni-ja mAb-Titterien määrittäminen

antigeeni-ja MAB-titterit määritettiin ELISA-menetelmällä. Aluksi valmistettiin HRP-konjugoidun MAB: n 2-kertaisia sarjalaimennoksia 1: 400-1: 25 600 1-prosenttisessa kaseiini PBS: ssä, minkä jälkeen ne lisättiin kuoppiin, jotka oli esikäsitelty p166w01-tai p166Chn-antigeenin sarjalaimennoksilla. Tämän jälkeen 45 minuutin inkubaatio 37°C: n lämpötilassa, sitoutumattomat mabit poistettiin pesemällä 5 kertaa PBST: llä. Värikehitystä varten lisättiin tetrametyylibentsidiininestesubstraattia 10 minuutin inkubaatiota varten 37°C: ssa. Lopuksi kunkin kaivon OD luettiin 450 nm: n aallonpituudella 630 nm: n vertailuaallonpituudella, jotta voitiin määrittää alaturoituva laimennus, joka antoi OD-lukemaksi noin 1,0 450 nm: n aallonpituudella 630 nm: n vertailuaallonpituudella.

Competitive Binding Assay

HEV: n yleisten ja genotyyppispesifisten neutraloivien epitooppien erilaisia ominaisuuksia tutkittiin käyttäen pairwise competitive binding assay-testiä, joka oli määritetty yleisillä ja genotyyppispesifisillä neutraloivilla mAbs: llä . Menetelmät olivat samanlaisia kuin edellä kuvatut menetelmät, paitsi että päällystysantigeenina käytettiin p166W01: tä ja p166chn: ää, ja pinnoitettuihin kuoppiin lisättiin HRP-konjugoituneen mAb: n seoksia, joiden pitoisuus oli kaksinkertainen ja tyydyttynyt konjugoitumattoman MAB: n pitoisuus. Od mitattiin 450 nm: n aallonpituudella 630 nm: n vertailuaallonpituudella. Estoprosentti laskettiin kaavalla 100 × . Kilpailu arvioitiin positiiviseksi, jos estoprosentti oli yli 50.

tulokset

HRP-konjugoituneen mabsin ristireaktiivisuus Heterologiseen p166-antigeeniin

ELISA-menetelmää käytettiin arvioimaan HRP-konjugoituneen mabsin ristireaktiivisuutta p166w01-ja p166Chn-antigeeneihin. Tulokset osoittivat, että HRP-konjugoitu 2B1 reagoi laimennoksissa 1: 400-1: 25600 vain p166w01: n kanssa, mutta ei p166Chn: n kanssa, ja HRP-konjugoitu 4C5 laimennuksissa 1: 400-1: 25600 reagoi vain p166Chn: n kanssa. Sen sijaan HRP-konjugoidut 3G1 ja 5G5 laimennoksissa 1: 400-1: 25 600 reagoivat hyvin 2 p166-proteiinin kanssa (kuva. 1). Nämä havainnot olivat samankaltaisia kuin aiemmat havainnot, 2B1 ja 4C5 ovat genotyyppispesifisiä mAbs: iä, kun taas 3g1 ja 5G5 ovat genotyypin yleisiä mAbs: iä .

p166w01-antigeenin ja HRP-konjugoitujen mAb-Titterien määritys Kompetitiivista Sitoutumismääritystä

p166W01-antigeenin kompetitiivista sitoutumismääritystä varten käytettiin mabs 2B1 -, 3g1-ja 5g5-kompetitiivisen sitoutumismäärityksen määrittämiseen; mabs: n ja antigeenin oikeat titterit määritettiin ELISA-menetelmällä. Kuten taulukosta 1 ilmenee, neliötitrauksen jälkeen, kun p166w01-antigeenin laimennus oli 1: 400, HRP-konjugoitu 2B1 oli 1: 6400, OD: n keskiarvo oli lähellä 1, 0: ta. Kun antigeenin laimennos oli 1: 400, HRP-konjugoitu 5G5 ja HRP-konjugoitu 3G1 olivat vastaavasti 1: 6400 ja 1: 12800, ja OD: n keskiarvo oli lähellä 1, 0.

p166chn-antigeenin ja HRP-konjugoitujen mAb-Titterien määritys Kompetitiivista Sitoutumismääritystä

p166Chn-antigeenin kompetitiivista sitoutumismääritystä varten käytettiin mabs 4C5 -, 3g1-ja 5g5-kompetitiivisen sitoutumismäärityksen määrittämiseen. Kuten taulukosta 3 ilmenee, neliötitrauksen jälkeen, kun p166chn-antigeenin laimennus oli 1: 800, HRP-konjugoitu 4C5 oli 1: 6400 ja OD: n keskiarvo oli lähellä 1, 0: ta. Kun antigeenin laimennus oli 1: 800, HRP-konjugoituneen 5G5: n ja HRP-konjugoituneen 3G1: n laimennokset olivat vastaavasti 1: 6400 ja 1: 12800, kuten taulukosta 4 ilmenee, ja OD: n keskiarvo oli lähellä 1, 0: ta.

Mabs: n sitoutumisen estäminen p166w01: een

eston tulokset on esitetty taulukossa 5; konjugoitumattoman 2B1: n sitoutuminen p166W01-antigeeniin estyi 68%: n estolla. Mabs 5G5: n ja 3g1: n välillä ei ollut merkitsevää inhibitiota (27% ja 30%). Täydellisempää inhibitiota saatiin heterologisista mAbs 3G1: stä ja 5g5: stä, sillä HRP-3G1: n sitoutuminen antigeeniin estettiin 5g5: llä 61%: n inhibitiolla, HRP-konjugoitua 5G5: tä antigeeniin estettiin 3G1: llä 99%: n inhibitiolla. Myös HRP-3g1: n ja HRP-5G5: n sitoutuminen p166w01-antigeeniin estettiin lähes kokonaan itse (81-ja 80-prosenttinen inhibitio). Nämä tulokset viittaavat siihen, että 3G1 ja 5g5 saattavat jakaa saman epitoopin tai päällekkäisen epitoopin, mutta 2B1 luultavasti tunnistaa eri epitoopin.

MABS: n sitoutumisen esto p166chn: ään

eston tulokset on esitetty taulukossa 5: konjugoimaton 4C5 esti HRP-4C5: n sitoutumisen p166chn: ään 69% estolla, muista 2 konjugoimattomasta mAbs: stä 3g1 ja 4C5 ei saatu merkittävää estoa (25% ja 30%). Suurempi estonopeus saatiin kuitenkin aikaan, kun HRP: n konjugoituneet mAbs 3g1 ja 5g5 sitoutuivat antigeeniin ja kun konjugoitumattomat 5g5 ja 3g1 estivät sitä 65-ja 76-prosenttisesti. Myös HRP-konjugoituneen 3g1: n ja HRP-konjugoituneen 5G5: n sitoutuminen p166Chn-antigeeniin estyi lähes itsestään. Nämä tulokset viittaavat myös siihen, että 3G1 ja 5g5 saattavat jakaa saman epitoopin tai päällekkäisen epitoopin, kun taas 4C5 luultavasti tunnistaa eri epitoopin.

Keskustelu

sen jälkeen , kun uusi sian HEV eristettiin ensimmäisen kerran, HEV-vasta-aineita on raportoitu monilla eläimillä, paljastettu HEV-infektio eläimillä ja ihmisillä, ja tämä saattaa tarttua eläimistä ihmisiin . Hepatiitti E: n sairastavuuden ja kuolleisuuden väheneminen riippui rokotteen ehkäisystä ja tehokkaasta diagnosoinnista. HEV: n epitooppien tuntemus oli olennaista rokotteen valmistamisen ja diagnostisen kehittämisen kannalta . Spesifisten vasta-aineiden osoittaminen seerumista on yksi tärkeimmistä diagnostisista menetelmistä, ja serologisia vasta-aineiden määrityksiä tehdään yhä enemmän. Spesifisten vasta-aineiden havaitsemiseen käytettyjen määritysten herkkyys vaihtelee kuitenkin huomattavasti . Joissakin kaupallisissa genotyypin 1 tai 2 antigeeneihin perustuvissa diagnostisissa määrityksissä ei havaita seerumin vasta-aineita genotyypin 3 tai 4 isolaatteja vastaan . Eri diagnostisten määritysten vastaamattomuuden taustalla olevista mekanismeista tiedetään vain vähän.

tällä hetkellä HEV-tutkimusta varten ei ole vielä saatavilla in vitro-soluviljelyjärjestelmää. Siksi useimpia immunogeenisia kohtia sisältävää pORF2: ta on käytetty laajalti HEV-immunologisessa tutkimuksessa, jonka luonne on konformaatiosta riippuvainen . Neutraloivia ja suojaavia vasta-aineita synnyttävän immunogeenin rakenteellinen perusta on neutraloiva epitooppi, joka on hepatiitti E-rokotteen kehittämisen pääkohde . Olemme aiemmin raportoineet, että p166-proteiini, porf2: n typistetty proteiini, voi mallintaa HEV-neutralisoivaa epitooppia, ja p166: ta vastaan nostetut vasta-aineet voivat ristineutralisoida HEV: n eri genotyyppejä . Lisäksi genotyypin 1 HEV-rokotteesta johdettu hepatiitti E p239-rokote oli tehokas vaiheen 3 kliinisessä tutkimuksessa, joka tehtiin Kiinan Jiangsun maakunnassa, jossa epidemian HEV-isolaatti on genotyyppi 4 . Nämä löydökset osoittivat, että HEV: n eri genotyypeissä on yhteisiä neutraloivia epitooppeja. Tavallisen neutraloivan epitoopin (- epitooppien) lisäksi myös genotyyppi-SPE cific epitoopin (- epitooppien) on vahvistettu olevan olemassa mAb: n valmistusta ja karakterisointia varten .

yhteisten ja genotyyppispesifisten neutraloivien epitooppien luonnehdinnan tarkentamiseksi perustettiin kompetitiivinen inhibitiomääritys yhteisillä neutraloivilla mAbs: llä (3g1 ja 5g5) ja genotyyppispesifisillä neutraloivilla mAbs: llä (2B1 ja 4C5), joilla tutkittiin kilpailevaa sitoutumista p166w01-tai p166chn-antigeeniin ja sen määrittämiseksi, tunnistavatko mAbs riippumattomat, samankaltaiset tai päällekkäiset epitoopit.

aluksi valmistettiin mabs 3G1, 2B1, 5G5 ja 4C5: n askeettisia nesteitä, puhdistettiin ja konjugoitiin HRP: llä. ELISA-menetelmää käytettiin vertaamaan HRP: n konjugoituneiden mAbs: n sitoutumisreaktiota HEV p166: n eri genotyyppeihin. Tulokset osoittivat, että HRP-konjugaatti ed 2B1 reagoi vain genotyypin 1 p166W01 kanssa, mutta ei p166Chn. Vastaavasti HRP-konjugoitu 4C5 reagoi vain p166chn: n kanssa. Sen sijaan HRP-konjugoituneet 3g1 ja 5g5 reagoivat hyvin 2 genotyypin p166-proteiineja vastaan. Kilpailulliset sidontamääritykset perustuvat genotyypin 1 ja 4 HEV p166 antigeeneihin. Kilpailullisten sidontamääritysten tulokset eivät yllätä, ts. että 2B1: n Sitominen p166w01: een kilpaili vain itsestään, kun taas 3G1 ja 5G5 saattoivat kilpailla keskenään sitomisesta p166w01: een. Lisäksi 4C5: n sitomisesta p166chniin kilpaili samalla tavalla vain itse, mutta 3G1 ja 5g5 pystyivät kilpailemaan keskenään sitomisesta p166chniin. Nämä havainnot osoittivat, että 3G1 ja 5g5 tunnistavat samat tai päällekkäiset epitoopit ja 2B1 ja 4C5 tunnistavat eri epitoopit.

tämä on ensimmäinen tutkimus, joka tutkii genotyypille tyypillisten ja genotyypille ominaisten konformaatiota neutraloivien epitooppien eri ominaisuuksia. Osoitimme, että yleiset ja genotyyppikohtaiset neutraloivat epitoopit voivat olla itsenäisiä. Tämä havainto on erittäin hyödyllinen, jotta voidaan osoittaa eri diagnostisten määritysten alhaisen vastaavuuden taustalla olevat mekanismit. Lisätutkimukset ovat ratkaisevan tärkeitä HEV: n neutraloivien epitooppien eri ominaisuuksien selvittämisessä diagnostisen kehityksen ja rokotteen valmistuksen tehokkuudessa.

tunnustus

tätä työtä tuki Anhui Medical Universityn tieteellinen tutkimussäätiö (nro 0110037101).

tiedonanto

laatijat ilmoittavat, ettei eturistiriitoja ole.

artikkeli / julkaisutiedot

Copyright / Drug dose / Disclaimer

Copyright: Kaikki oikeudet pidätetään. Mitään tämän julkaisun osaa ei saa kääntää muille kielille, jäljentää tai käyttää missään muodossa tai millään sähköisellä tai mekaanisella tavalla, mukaan lukien valokopiointi, tallennus, mikrokopiointi tai mikään Tietojen tallennus-ja hakujärjestelmä ilman julkaisijan kirjallista lupaa.
huumeiden annostus: tekijät ja julkaisija ovat pyrkineet kaikin tavoin varmistamaan, että tässä tekstissä esitetyt lääkkeiden valinta ja annostus ovat julkaisuhetkellä voimassa olevien suositusten ja käytäntöjen mukaisia. Meneillään olevan tutkimuksen, hallituksen säännösten muutosten sekä lääkehoidosta ja lääkereaktioista kertovan jatkuvan tiedonkulun vuoksi lukijaa kehotetaan kuitenkin tarkistamaan kunkin lääkkeen pakkausselosteesta mahdolliset käyttöaiheiden ja annostuksen muutokset sekä lisätyt varoitukset ja varotoimet. Tämä on erityisen tärkeää, kun suositeltu aine on uusi ja / tai harvoin käytetty lääke.
Vastuuvapauslauseke: tämän julkaisun sisältämät lausunnot, lausunnot ja tiedot ovat ainoastaan yksittäisten kirjoittajien ja avustajien lausuntoja, eivät kustantajien ja julkaisijan(julkaisijoiden) lausuntoja. Mainosten tai/tai tuoteviitteiden esiintyminen julkaisussa ei takaa, vahvista tai hyväksy mainostettuja tuotteita tai palveluita tai niiden tehokkuutta, laatua tai turvallisuutta. Julkaisija ja toimittaja(t) eivät ole vastuussa mistään henkilöihin tai omaisuuteen kohdistuvasta vahingosta, joka johtuu ideoista, menetelmistä, ohjeista tai tuotteista, joihin sisällössä tai mainoksissa viitataan.