Mitä Southern Blotting on?

Hannah Simmons, M. Sc.arvostellut Kate Anderton, B.Sc

blottaus on prosessi, jossa DNA, RNA tai proteiinit siirretään kalvolle visualisoitaviksi.

Credit: Paul Cowan/. com

ensimmäinen näistä menetelmistä oli Edward Southernin vuonna 1975 kehittämä Southern Blotting, jota käytetään DNA-fragmenttien sekvenssin selvittämiseen. Sittemmin on kehitetty kaksi muuta menetelmää, joita kutsutaan pohjoiseksi ja Läntiseksi blottaukseksi. Nämä ovat prosesseja, joita käytetään tunnistamaan RNA ja proteiini sekvenssit, vastaavasti.

etelän blottausmenetelmä

DNA-fragmentit tuotetaan aluksi restriktioentsyymeillä ja erotellaan koon mukaan geelielektroforeesiksi kutsutussa prosessissa. Tämän jälkeen emäksiä käytetään denaturoimaan kaksijuosteinen DNA, jolloin muodostuu yksittäisiä säikeitä. Tämän jälkeen DNA siirretään nitroselluloosalle tai nailonlevylle asettamalla kalvo geelin päälle ja puskurivirran avulla kannustamaan DNA: n liikettä geelistä kalvoon.

Kapillaarivirtaus ja tyhjiösiirto ovat kaksi yleisintä DNA-fragmenttien siirtomenetelmää. Kapillaarivirtauksessa geeli asetetaan puskurin tason yläpuolelle tukikappaleeseen, jonka päälle on asetettu kalvo. Tämän jälkeen kalvon päälle asetetaan pino imukykyisiä pyyhkeitä, joiden avulla puskuri imeytyy geelin alta nostaen DNA-fragmentit ylös kalvolle.

tyhjiösiirrolla kalvo asetetaan geelin alle ja molemmat upotetaan puskuriin. Tyhjiössä syntyy virtaus,joka vetää DNA-palaset kalvolle.

kuumentamalla tai UV-säteilyllä varmistetaan, että DNA-fragmentit pysyvät kiinni kalvossa pysyvästi säilyttäen samalla DNA: n ominaisjärjestyksen. Yksijuosteisia leimattuja luotaimia käytetään sitten sitoutumaan kohdesekvensseihin.

arkki inkuboidaan näillä koettimilla ja vain toisiaan täydentävät koettimet sitovat. Komplementaariset koettimet pestään sitten kalvosta, jolloin varmistetaan, että vain sidotut koettimet jäävät jäljelle. Nämä luotaimet voidaan sitten havaita autoradiografialla, joka paljastaa hybridisaation kuvion röntgenfilmillä.

eteläisen blottauksen käyttökohteita

eteläisen blottauksen käyttökohteita on monia. Ensinnäkin voidaan analysoida geenien uudelleenjärjestelyjä. Esimerkiksi immunologiassa tätä menetelmää voidaan käyttää T-solujen reseptorigeenien kloonisten uudelleenjärjestelyjen tunnistamiseen. Toiseksi DNA: n tietyt fragmentit voidaan tunnistaa monien muiden fragmenteiden seoksesta.

muita käyttöesimerkkejä ovat sekä restriction fragment length polymorphism (RFLP) että variable number tandem repeat (vntr) – analyysi. RFLP käyttää pituuseroja homologisissa DNA-sekvensseissä genomien kartoittamiseen, ja sitä voidaan käyttää oikeuslääketieteellisissä ja isyystesteissä.

VNTR-analyysissä käytetään toistuvien nukleotidisekvenssien pituuseroja DNA-sormenjäljen muodostamiseksi.

näitä menetelmiä voidaan käyttää myös mutaation aiheuttaman sairauden, esimerkiksi sirppisoluanemian diagnosoinnissa. Tämä geneettinen tila johtuu yhden nukleotidin polymorfismi (A-T) beta-globiini geeni, mikä johtaa epänormaali hemoglobiini.

eteläistä blottausta Fragile X-syndrooman

eteläistä blottia on käytetty laajasti geenien tunnistamiseen monistetuilla toistuvilla alueilla. Nämä ovat lyhyitä, toistuvia sekvenssejä DNA: ssa, jotka eivät koodaa geenituotteita. Yksi esimerkki, jossa eteläinen blottaus voi olla hyödyllinen, on Fragile X-oireyhtymän diagnosoinnissa. Tämä geneettinen tila johtuu lisääntymisestä CGG / CCG toistuva alue, joka sijaitsee sisällä FMR1 geeni.

tämä geeni sisältää yleensä 5-40 toistuvaa aluetta. Henkilöillä, joilla on 55-200 toistoa, on fmr1-geenin premutaatio, ja henkilöillä, joilla on >200 toistoa, on fragile X-oireyhtymä. Toistojen lisääntyminen johtaa geenin metylaatioon, joka estää transkriptiota ja estää fmrp-proteiinin tuotannon. Tätä proteiinia tarvitaan hermoston normaaliin toimintaan, joten proteiinin toiminnan menetys johtaa fragile X-oireyhtymän oireisiin.

taudinmäärityksessä käytetään metylaatioherkkää restriktioentsyymiä EclX1 ja Metylaatioherkkää entsyymiä EcoR1, jotta voidaan erottaa metyloidut alleelit ja metyloimattomat alleelit. Metyloidut alleelit leikataan vain kerran, jolloin yksittäinen DNA-fragmentti on 5,1 kb.

kuitenkin metyloimattomat alleelit leikataan kahteen kertaan, jolloin saadaan 2,8 kb: n kappale. Metyloimattomat premutaatiokokeet (<200) voidaan siis erottaa metyloiduista mutaatiokokoelmista, joiden pituus on noin 200 toistoa, sillä eteläistä blottausta voidaan käyttää DNA-fragmenttien koon selvittämiseen.

Future perspectives

kaiken kaikkiaan Eteläinen blottaus on tärkeä menetelmä sairauden (kuten fragile X-syndrooman ja sirppisoluanemian) diagnosoinnissa ja tutkimuksessa sekä DNA-analyysissä muista syistä (kuten oikeuslääketieteellisistä ja isyystesteistä).

etelän blottaus on kuitenkin teknisesti hyvin monimutkaista, kallista, työlästä ja vaatii suuren määrän DNA-näytettä. Uudet menetelmät ovat siis hiljalleen korvaamassa eteläisen blottauksen, esimerkiksi reaaliaikaisen PCR: n. Tämä prosessi on paljon helpompi ja nopeampi kuin eteläinen blottaus ja vaatii vain hyvin pienen määrän DNA: ta.

lisätietoja

• kaikki genetiikan sisältö
• mitä genetiikka on?
• genetiikan historia
• genetiikka ja geeniekspressio
• geneettinen muutos

kirjoittanut

Hannah Simmons

Hannah on lääketieteen ja biotieteiden kirjoittaja, koulutukseltaan filosofian maisteri (M.Sc.) tutkinto Lancasterin yliopistosta, Iso-Britanniasta. Ennen kirjailijaksi ryhtymistä Hannahin tutkimus keskittyi Alzheimerin ja Parkinsonin taudin biomarkkereiden löytämiseen. Hän työskenteli myös selvittääkseen edelleen näiden sairauksien biologisia reittejä. Työnsä ulkopuolella Hannah nauttii uimisesta, koiransa ulkoiluttamisesta ja maailman kiertämisestä.

lainaukset