Proteiinin puhdistus
lähtöaineen valinta on avain puhdistusprosessin suunnitteluun. Kasvissa tai eläimessä tietty proteiini ei yleensä jakaudu tasaisesti koko kehoon; eri elimissä tai kudoksissa proteiinin pitoisuus on suurempi tai pienempi. Vain niiden kudosten tai elinten käyttö, joissa pitoisuus on suurin, vähentää tietyn määrän puhdistettua proteiinia tuottamiseen tarvittavia määriä. Jos proteiinia on vähän tai jos sillä on suuri arvo, tutkijat voivat käyttää yhdistelmä-DNA-tekniikkaa kehittääkseen soluja, jotka tuottavat suuria määriä haluttua proteiinia (tätä kutsutaan ilmentymäjärjestelmäksi). Rekombinantti-ekspression avulla proteiini voidaan merkitä esimerkiksi His-tagilla tai Strep-tagilla puhdistuksen helpottamiseksi, mikä vähentää tarvittavien puhdistusvaiheiden määrää.
analyyttinen puhdistus käyttää yleensä kolmea ominaisuutta proteiinien erottamiseen. Ensin proteiinit voidaan puhdistaa isoelektristen pisteidensä mukaan juoksuttamalla ne pH-luokitellun geelin tai ioninvaihtopylvään läpi. Toiseksi proteiinit voidaan erottaa niiden koon tai molekyylipainon mukaan koon poissulkukromatografialla tai SDS-PAGE-analyysillä (natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi). Proteiinit puhdistetaan usein 2D-sivun avulla, minkä jälkeen ne analysoidaan peptidimassalla sormenjälkien avulla proteiinin identiteetin selvittämiseksi. Tämä on erittäin hyödyllistä tieteellisissä tarkoituksissa, ja proteiinin havaitsemisrajat ovat nykyään hyvin alhaiset ja nanogrammojen proteiinimäärät riittävät niiden analysointiin. Kolmanneksi proteiinit voidaan erottaa polaarisuuden/hydrofobisuuden avulla korkean erotuskyvyn nestekromatografialla tai käänteisfaasikromatografialla.
yleensä proteiinin puhdistusprotokolla sisältää yhden tai useamman kromatografisen vaiheen. Perusmenetelmä kromatografiassa on valuttaa proteiinia sisältävä liuos kolonnin läpi, joka on pakattu eri materiaaleihin. Eri proteiinit vuorovaikuttavat eri tavoin kolonnimateriaalin kanssa, ja näin ne voidaan erottaa kolonnin läpäisyyn kuluvalla ajalla tai ehdoilla, jotka vaaditaan proteiinin eluoimiseksi kolonnista. Yleensä proteiinit havaitaan, kun ne irtoavat kolonnista absorbanssinsa perusteella 280 nm: ssä. On olemassa monia erilaisia kromatografisia menetelmiä:
Kokoerottelukromatografiamedit
kromatografiaa voidaan käyttää proteiinin erottamiseen liuos-tai denaturointiolosuhteissa käyttämällä huokoisia geelejä. Tätä tekniikkaa kutsutaan koon poissulkukromatografiaksi. Periaate on, että pienempien molekyylien on kuljettava suurempi tilavuus huokoisessa matriisissa. Näin ollen tietyn kokoiset proteiinit vaativat vaihtelevan määrän eluenttia (liuotinta) ennen kuin ne kerätään geelikolonnin toiseen päähän.
proteiinin puhdistuksen yhteydessä eluentti yhdistetään yleensä eri koeputkiin. Kaikki koeputket, joissa ei ole mitattavia jälkiä puhdistettavasta proteiinista, hävitetään. Jäljelle jäävä liuos muodostuu siis puhdistavasta proteiinista ja muista samankokoisista proteiineista.
varaukseen tai hydrofobisuuteen perustuva erottelu
hydrofobinen vuorovaikutus kromatografiamedit
HIC-väliaine on amfifiili, jossa on sekä hydrofobisia että hydrofiilisiä alueita, mikä mahdollistaa proteiinien erottamisen niiden pintahydrofobisuuden perusteella. Kohdeproteiineilla ja niiden aggregaattilajeilla on yleensä erilaisia hydrofobisia ominaisuuksia, ja niiden poistaminen HIC: n avulla puhdistaa edelleen kiinnostavaa proteiinia. Lisäksi käytetty ympäristö käyttää tyypillisesti vähemmän ankaria denaturointiolosuhteita kuin muut kromatografiatekniikat, mikä auttaa säilyttämään kiinnostavan proteiinin sen alkuperäisessä ja toiminnallisessa tilassa. Puhtaassa vedessä hartsin ja proteiinin hydrofobisten alueiden väliset vuorovaikutukset olisivat hyvin heikkoja, mutta tätä vuorovaikutusta tehostetaan levittämällä HIC-hartsille proteiininäyte korkean ionivahvuuden puskurissa. Tämän jälkeen puskurin ionivahvuus pelkistyy eluuttoproteiineiksi hydrofobisuuden vähentyessä.
Ioninvaihtokromatografiedit
Ioninvaihtokromatografia erottaa yhdisteet niiden ionivarauksen luonteen ja asteen mukaan. Käytettävä kolonni valitaan sen tyypin ja varauslujuuden mukaan. Anioninvaihtohartseilla on positiivinen varaus ja niitä käytetään negatiivisesti varautuneiden yhdisteiden (anionien) säilyttämiseen ja erottamiseen, kun taas kationinvaihtohartseilla on negatiivinen varaus ja niitä käytetään positiivisesti varautuneiden molekyylien (kationien) erottamiseen.
ennen erotuksen alkua puskuria pumpataan kolonnin läpi vastakkaisten varautuneiden ionien tasapainottamiseksi. Injektoitaessa näytettä, liuotinmolekyylit vaihtuvat puskuri-ionien kanssa, kun kukin kilpailee hartsin sitoutumispaikoista. Pituus säilyttäminen kunkin solute riippuu vahvuus sen varauksen. Heikoimmin varautuneet yhdisteet eluoituvat ensin, ja sen jälkeen ne, joilla on peräkkäin voimakkaammat varaukset. Erotusmekanismin luonteen vuoksi pH: lla, puskurityypillä, puskuripitoisuudella ja lämpötilalla on kaikilla tärkeä rooli erotuksen ohjaamisessa.
Ioninvaihtokromatografia on erittäin tehokas väline proteiinien puhdistuksessa ja sitä käytetään usein sekä analyyttisissä että preparatiivisissa separaatioissa.
vapaasti virtaava elektroforesedit
Vapaaelektroforeesi (ffe) on kantoelektroforeesitekniikka, joka mahdollistaa preparatiivisen proteiinin erottamisen laminaarisessa puskurivirrassa ortogonaalisen sähkökentän avulla. Käyttämällä pH-gradienttia, joka voidaan indusoida esimerkiksi amfolyyteillä, tämä tekniikka mahdollistaa proteiinin isoformien erottamisen jopa resoluutiolla < 0,02 delta-pI.
Affinity kromatographyedit
Affiniteettikromatografia on molekyylin konformaatioon perustuva erotustekniikka, jossa käytetään usein käyttökohtaisia hartseja. Näiden hartsien pinnoille on kiinnittynyt ligandeja, jotka ovat spesifisiä erotettaville yhdisteille. Useimmiten nämä ligandit toimivat samalla tavalla kuin vasta-aine-antigeeni-vuorovaikutukset. Tämä” Lukko ja avain ” sopivat ligandin ja sen kohdeyhdisteen väliin, mikä tekee siitä erittäin spesifisen, jolloin syntyy usein yksi piikki, kun taas kaikki muu näytteessä ei ole.
monet kalvoproteiinit ovat glykoproteiineja ja ne voidaan puhdistaa lektiinin affiniteettikromatografialla. Pesuaineliukoisten proteiinien voidaan antaa sitoutua kromatografiahartsiin, johon on modifioitu kovalenttisesti kiinnittynyt lektiini. Proteiinit, jotka eivät sitoudu lektiiniin, pestään pois, minkä jälkeen erityisesti sitoutuneet glykoproteiinit voidaan eluoida lisäämällä lektiinin sitoutumiskohdassa sitoutuneiden glykoproteiinien kanssa kilpaileva suuri sokeripitoisuus. Joillakin lektiineillä on suuri affiniteetti sitoutuessaan glykoproteiinien oligosakkarideihin, joiden on vaikea kilpailla sokereiden kanssa, ja sitoutuneita glykoproteiineja on vapautettava denaturoimalla lektiini.
Immunoaffiniteettikromatografiamedit
Immunoaffiniteettikromatografiassa käytetään vasta-antigeenin spesifistä sitoutumista kohdeproteiinin selektiiviseen puhdistamiseen. Toimenpiteessä proteiini immobilisoidaan kiinteään alustaan (esim.huokoinen helmi tai kalvo), joka sitten sitoo valikoivasti kohteen, kun taas kaikki muu virtaa läpi. Kohdeproteiini voidaan eluoida muuttamalla pH: ta tai suolapitoisuutta. Immobilisoitu ligandi voi olla vasta-aine (kuten immunoglobuliini G) tai se voi olla proteiini (kuten proteiini A). Koska tähän menetelmään ei liity merkintää, sitä voidaan käyttää luonnollisista lähteistä peräisin oleviin proteiineihin.
merkityn proteineditin Puhdistus
toinen tapa merkitä proteiinit on valmistaa antigeenipeptidilappu proteiiniin ja puhdistaa proteiini sitten kolonnissa tai inkuboimalla löysällä hartsilla, joka on päällystetty immobilisoidulla vasta-aineella. Tämä erityinen menettely tunnetaan immunoprecipitation. Immunopresipitaatio kykenee varsin hyvin tuottamaan äärimmäisen spesifisen vuorovaikutuksen, joka yleensä johtaa vain halutun proteiinin sitomiseen. Puhdistetut merkityt proteiinit voidaan sitten helposti erottaa muista liuoksessa olevista proteiineista ja eluoida myöhemmin takaisin puhtaaksi liuokseksi.
kun tageja ei enää tarvita, ne voidaan pilkkoa pois proteaasilla. Tämä edellyttää usein proteaasin pilkkoutumiskohdan rakentamista tagin ja proteiinin välille.
HPLCEdit
korkean erotuskyvyn nestekromatografia tai korkeapaineinen nestekromatografia on kromatografian muoto, jossa käytetään korkeaa painetta liuottimien ajamiseksi kolonnin läpi nopeammin. Tämä tarkoittaa, että diffuusio on rajallinen ja resoluutio on parantunut. Yleisin muoto on” käänteisfaasi ” HPLC, jossa kolonnimateriaali on hydrofobinen. Proteiinit eluoidaan gradientilla, jossa on yhä enemmän orgaanista liuotinta, kuten asetonitriiliä. Proteiinit eluoituvat hydrofobisuutensa mukaan. HPLC: n puhdistuksen jälkeen proteiini on liuoksessa, joka sisältää vain haihtuvia yhdisteitä ja voidaan helposti kylmäkuivata. HPLC-puhdistus johtaa usein puhdistettujen proteiinien denaturoitumiseen, joten sitä ei voida soveltaa proteiineihin, jotka eivät palaudu itsestään.