Proteinaasi K
kalsiumin aktivoima entsyymi hajottaa proteiineja mieluiten hydrofobisten aminohappojen (alifaattisten, aromaattisten ja muiden hydrofobisten aminohappojen) jälkeen. Vaikka kalsiumionit eivät vaikuta entsyymin toimintaan, ne edistävät sen stabiilisuutta.Proteiinit pilkkoutuvat kokonaan, jos itämisaika on pitkä ja proteaasipitoisuus riittävän korkea. Kalsiumionien poistuessa entsyymin stabiilisuus heikkenee, mutta proteolyyttinen aktiivisuus säilyy. Proteinaasi K: lla on kaksi sitoutumiskohtaa Ca2+: lle, jotka sijaitsevat lähellä aktiivista keskustaa, mutta eivät suoraan osallistu katalyyttiseen mekanismiin. Jäännösaktiivisuus riittää sulattamaan proteiineja, jotka yleensä saastuttavat nukleiinihappovalmisteita. Siksi nukleiinihappojen puhdistukseen tarkoitettu digestio proteinaasi K: lla suoritetaan yleensä EDTA: n läsnä ollessa (metalli-ioniriippuvaisten entsyymien kuten nukleaasien inhibitio).
proteinaasi K on myös stabiili laajalla pH-alueella (4-12), ja sen pH-optimi on pH 8, 0.Reaktiolämpötilan nousu 37 °C: sta 50-60 °C: seen voi lisätä aktiivisuutta useita kertoja, kuten lisäämällä 0,5–1% natriumdodekyylisulfaattia (SDS) tai Guanidiniumkloridia (3 M), Guanidiniumtiosyanaattia (1 M) ja ureaa (4 M). Edellä mainitut olosuhteet tehostavat proteinaasi K: n aktiivisuutta tekemällä sen substraatin pilkkoutumispaikoista helpommin saavutettavia. Yli 65 °C: n lämpötila, trikloorietikkahappo (TCA) tai seriiniproteaasin estäjät AEBSF, PMSF tai DFP estävät toimintaa. Guanidiniumkloridi, Guanidiniumtiosyanaatti, urea, Sarkosyyli, Triton X-100, Tween 20, SDS, sitraatti, jodietikkahappo, EDTA tai muut seriiniproteaasin estäjät, kuten Na-Tosyyli-Lys Kloorimetyyliketoni (Tlck) ja Na-Tosyyli-Phe Kloorimetyyliketoni (TPCK), eivät estä proteinaasi K: ta.
proteaasi K-aktiivisuus yleisesti käytetyissä puskureissa
| Puskuri (pH = 8, 0, 50 °C, 1, 25 µg/mL proteaasi K, 15 min inkubaatio) | proteinaasi K-aktiivisuus (%) |
|---|---|
| 30 mM Tris * Cl | 100 |
| 30 mM Tris * Cl; 30 mm EDTA; 5% Tween 20; 0, 5% Triton X-100; 800 mM GuHCl | 313 |
| 36 mM Tris·Cl; 36 mM EDTA; 5% Tween 20; 0, 36% Triton X-100; 735 mM GuHCl | 301 |
| 10 mM Tris·Cl; 25 mM EDTA; 100 mM NaCl; 0, 5% SDS | 128 |
| 10 mM Tris * Cl; 100 mM EDTA; 20 mM NaCl; 1% Sarkosyyliä | 74 |
| 10 mM Tris·Cl; 50 mM KCl; 1, 5 mM MgCl2; 0, 45% Tween 20; 0, 5% Triton X-100 | 106 |
| 10 mM Tris * Cl; 100 mm EDTA; 0.5% SDS | 120 |
| 30 Mm Tris*Cl; 10 mm EDTA; 1% SDS | 203 |