RecA
RecA on DNA: n korjauksessa ja ylläpidossa välttämätön 38 kilodaltonin proteiini. RecA-rakenteellinen ja toiminnallinen homolog on löydetty jokaisesta lajista, josta sellaista on vakavasti etsitty, ja se toimii arkkityyppinä tälle homologisten DNA: n korjausproteiinien luokalle. Homologista proteiinia kutsutaan eukaryooteilla RAD51: ksi ja arkaaeilla RadA: ksi.
| recA bakteerien DNA-rekombinaatioproteiini | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|
RecA-DNA-kompleksin kiderakenne. PDB ID: 3cmt.
|
||||||
| Identifiers | ||||||
| Symbol | RecA | |||||
| Pfam | PF00154 | |||||
| Pfam clan | CL0023 | |||||
| InterPro | IPR013765 | |||||
| PROSITE | PDOC00131 | |||||
| SCOP2 | 2reb / SCOPe / SUPFAM | |||||
| Available protein structures: | Pfam | PDB | PDBsum | |||
Recalla on useita toimintoja, jotka kaikki liittyvät DNA: n korjaukseen. Bakteerien Sos-vasteessa sillä on ko-proteaasitoiminto LexA-repressorin ja λ-repressorin autokatalyyttisessä pilkkoutumisessa.
Recan yhteys DNA-Majoriin perustuu sen keskeiseen rooliin homologisessa rekombinaatiossa. RecA-proteiini sitoutuu voimakkaasti ja pitkinä rykelminä ssDNA: han muodostaen nukleoproteiinifilamentin. Proteiinilla on useampi kuin yksi DNA: n sitoutumiskohta, ja siten se voi pitää yhden juosteen ja kaksoisjuosteen yhdessä. Tämä ominaisuus mahdollistaa DNA: n kaksoiskierteen ja yksijuosteisen DNA: n toisiaan täydentävän alueen välisen DNA-synapsisreaktion katalysoimisen. RecA-ssDNA hehkulanka etsii sekvenssin samankaltaisuutta pitkin dsDNA. Häiriötön DNA-silmukka RecA: ssa, silmukka 2, sisältää jäämiä, jotka ovat vastuussa DNA: n homologisesta rekombinaatiosta. Joillakin bakteereilla Reca-translaation jälkeinen modifikaatio Loop 2: n seriinijäämän fosforylaation kautta voi häiritä homologista rekombinaatiota.
hakuprosessi indusoi DNA-dupleksin venymistä, mikä parantaa sekvenssien komplementaarisuuden tunnistamista (mekanismia kutsutaan konformatiiviseksi oikoluvuksi). Reaktio käynnistää säikeiden vaihdon kahden yhdistelmä-DNA-kaksoiskierteen välillä. Synapsis-tapahtuman jälkeen heteroduplexin alueella alkaa prosessi, jota kutsutaan haarasiirtymäksi. Haarasiirtymässä yhden säikeisen pariton alue syrjäyttää toisen yksittäisen juosteen parillisen alueen siirtäen haarapistettä muuttamatta emäsparien kokonaismäärää. Spontaania haarasiirtymää voi kuitenkin esiintyä, koska se etenee yleensä yhtä tasaisesti molempiin suuntiin, rekombinaation tehokas suorittaminen on epätodennäköistä. RecA-proteiini katalysoi yksisuuntaista haaravaihtoa ja mahdollistaa siten täydellisen rekombinaation tuottaen tuhansien emäsparien pituisen alueen heteroduplex-DNA: ta.
koska se on DNA: sta riippuvainen ATPaasi, RecA sisältää lisäkohdan ATP: n sitomiselle ja hydrolysoimiselle. RecA liittyy DNA: han tiukemmin silloin, kun siihen on sitoutunut ATP: tä kuin silloin, kun se on sitoutunut ADP: hen.
Escherichia coli-bakteerissa RecA: n välittämiä homologisia rekombinaatiotapahtumia voi esiintyä DNA: n replikaation jälkeisenä aikana, kun sisarten lokukset pysyvät läheisinä. RecA voi myös välittää homologista paritusta, homologista rekombinaatiota ja DNA: n katkeamiskorjausta E. coli-solun vastakkaisiin puoliskoihin jakautuneiden etäisten sisarten lokusten välillä.
RecA: n puutteelliset E. coli-kannat ovat hyödyllisiä kloonauksessa molekyylibiologian laboratorioissa. E. coli-kannat ovat usein geneettisesti muunnettuja niin, että ne sisältävät mutanttirekaalleelin ja varmistavat siten plasmideiksi kutsuttujen DNA: n ekstrakromosomaalisten segmenttien stabiilisuuden. Transformaatioksi kutsutussa prosessissa bakteerit ottavat plasmidin DNA: ta vastaan erilaisissa olosuhteissa. Eksogeenisia plasmideja sisältäviä bakteereja kutsutaan ”transformanteiksi”. Transformantit säilyttävät plasmidin koko solunjakautumisen ajan siten, että se voidaan ottaa talteen ja käyttää muissa sovelluksissa. Ilman toimivaa RecA-proteiinia eksogeeninen plasmidi-DNA jää bakteerien muuttumattomana. Tämän plasmidin puhdistaminen bakteeriviljelmistä voi mahdollistaa alkuperäisen plasmidijakson hifi-PCR-vahvistuksen.