tyrosinaasi
8.14.2.2.4 tyrosinaasi (EC 1.14.18.1) ja katekolioksidaasi (EC 1.10.3.1)
tyrosinaasi, joka kuuluu proteiiniperheeseen, jonka katalyyttinen keskus on tyypin 3 kaksinukleaarinen kupari, katalysoi ortohydroksylaatiota.monofenolin ja sitä seuraavan difenolituotteen hapettumisen tuloksena syntyväksi Kinoniksi.178 sarja reaktioita tapahtuu, kun molekylaarinen happi pelkistyy samanaikaisesti vedeksi. Kinonituote on reaktiivinen esiaste melaniinipigmenttien synteesissä. Vihanneksissa, hedelmissä ja sienissä oleva tyrosinaasi on keskeinen entsyymi ruskistuksessa, joka tapahtuu mustelmien tai pitkäaikaisen varastoinnin yhteydessä. Nisäkkäillä entsyymi aiheuttaa ihon pigmenttihäiriöitä, kuten laikkuja ja vikoja.179 tyrosinaasi on siis varsin merkittävä maatalouden ja teollisuuden aloilla. Kosmetiikkateollisuudessa voimakkaiden tyrosinaasin estäjien kehittäminen ja seulonta ovat erityisen houkuttelevia.
tyrosinaasi luokitellaan tyypin 3 kupariproteiiniperheeseen, kuten myös katekolioksidaasi ja hengityspigmentti hemosyaniini. Katalyyttisen reaktion aikana tyrosinaasin tyypin 3 kuparikeskus on olemassa kolmessa redox-muodossa.178 deoksimuoto (Cu(i)–Cu (i)) on pelkistynyt laji, joka sitoo happea antaen oksimuodon(cu(II) – O22–Cu (II)). Oksi-muodossa molekyylin happi sitoutuu peroksidina μ-η2:η2–sidostilassa, jolloin O-O-sidos horjuu ja aktivoituu. Met–muoto (Cu(II) – Cu(II)) oletetaan lepääväksi entsymaattiseksi muodoksi, jossa Cu(II) – ionit yleensä sulautuvat pieneen ligandiin, kuten vesimolekyyliin tai hydroksidi-ioniin.
Katekolioksidaasi hapettaa ortodifenolit vastaaviksi kinoneiksi, mutta sillä ei ole mono-oksigenaasi-tai kresolaasiaktiivisuutta. Hemosyaniini toimii hapenkantajana niveljalkaisilla ja nilviäisillä.
Streptomyces castaneoglobisporus HUT 620268: n tyrosinaasin ja bataatti Ipomoea batatas180: n katekolioksidaasin kiderakenteet on määritetty. Ne vahvistavat, että tyypin 3 kuparin koordinaatio tyrosinaasissa ja katekolioksidaasissa on hyvin samanlainen kuin hemosyaniinissa. Tämä oli päätelty aiemminkin spektroskooppisten ominaisuuksien samankaltaisuudesta ja monien tyrosinaasi-ja hemosyaniiniprimäärirakenteiden vertailusta.181-183 proteiinien biologisen lähteen perusteella voitiin tunnistaa seitsemän eri toimialueen organisaatiota. Eri eliöiden kasvien katekolioksidaasien sekvenssidentiteetti on noin 40-60%. Katekolioksidaasien ja mulluskan hemosyaniinien välinen sekvenssidentiteetti on noin 35% lähes koko sekvenssien pituudelta. Sen sijaan kasvien katekolioksidaasien ja mistä tahansa ei-kasvilähteestä peräisin olevien muiden tyypin 3 kupariproteiinien välinen sekvenssidentiteetti rajoittuu kahteen kuparia sitovaan alueeseen.
kahden kuparia sitovan alueen säilyvyys on korkein kaikissa tyypin 3 kupariproteiineissa. Erityisesti aluetta sitova CuB on hyvin säilynyt, kun taas CuA-sitova alue osoittaa enemmän sekvenssivaihtelua ja on katsottu olevan vastuussa tyrosinaasin, katekolioksidaasin ja hemosyaanin eri toiminnoista.
tyrosinaasin Kokonaisrakenne S. castaneoglobisporus kompleksissa avoimella lukukehyksellä ORF378 näkyy kuvassa 23. Tyrosinaasi ottaa α-kierteiset rakenteet entsyymin ytimen kanssa, josta muodostuu nelikierteinen nippu. Katalyyttinen kaksinukleaarinen kuparikeskus on jätetty kierteiseen nippuun (Kuva 23). Kumpaakin aktiivisen kohdan kahdesta kupari-ionista koordinoi kolme hänen jäännöstään (Kuva 24), jotka ovat peräisin α-nipun neljästä kierteestä his 54: ää lukuun ottamatta. Yhtä kupari-Ionia (nimetty CuA) koordinoivat His38, His54 ja His63. His38 ja His63 sijaitsevat α2: n ja α3: n välimaastossa. Toista kupari-Ionia (CuB) koordinoivat His190, His194 ja His216. Jäännökset His190 ja His194 ovat α6: n alussa ja keskellä, ja His216 on α7: n keskellä. Tämä dikuparikeskus sijaitsee suuren kovakiven pohjalla hydrofobisten jäämien muodostamana putatiivisena alustaa sitovana taskuna. Kierteisen rakenteen lisäksi tyrosinaasissa on muutamia β-rakenteita selkärangan vääntökulmien perusteella arvioituna. Näissä vain N – ja C-terminaaliset β-säikeet muodostavat arkkirakenteen.
Kuva 23. Streptomyces castaneoglobisporus-bakteerin tyrosinaasin nauhakaavio kompleksissa ORF378: n kanssa (PDB-koodi: 1wx3). Tyrosinaasi ja ORF378 on esitetty vaaleanpunainen ja vadelma, vastaavasti. Kupari-ionit CuA ja CuB on kuvattu keltaisina palloina; valmistettu Pymolilla (W. L. DeLano, Palo Alto, 2003).
Kuva 24. Streptomyces castaneoglobisporus-bakteerin tyrosinaasin aktiivisen keskuksen met-muoto (PDB-koodi: 1wx3); valmistettu Pymolilla (W. L. DeLano, Palo Alto, 2003).
vaikka tyrosinaasin aminohappojärjestyksessä on vain 25,3 ja 26,0% identiteettejä I. batatasin katekolioksidaasin 180 ja Octopus dofleini hemosyaniinin odg-domeenin 184 kanssa,sen yleinen rakenne on melko samanlainen kuin omansa. Näistä kolmesta proteiinista α-nipun muodostamalla ydinalueella on havaittu suurta säilymistä. Panulirus interruputus185: n ja L: n tyrosinaasi ja hemosyaanit. polyfemus66: ssa ei ole merkittävää homologiaa eikä niiden rakenteissa ole yhdennäköisyyttä, mutta näiden proteiinien katalyyttiset ydinalueet ovat päällekkäisiä.
S. castaneoglobisporus-bakteerin tyrosinaasille voitiin kiderakenteissa luonnehtia viisi eri aktiivisen kohdan tilaa, nimittäin kupariton muoto, met-muoto I, met-muoto II, deoksi ja oksi. I. batatasta peräisin olevan katekolioksidaasin kiderakenteissa on selvitetty met-ja deoksitilat sekä inhibiittorikompleksi. Met-tilassa(Cu(II), Cu(II)) kaksi kupari-Ionia ovat etäisyydellä 2.9 Å, joista jokaista koordinoi kolme histidiiniä. Niitä yhdistää toinen atomi, todennäköisesti hydroksidi-ioni, noin 1,8 Å: n etäisyydellä kustakin kupari-ionista niin, että jokaisella niistä on koordinaatioluku 4 (ks.Kuva 24, joka osoittaa saman tilanteen tyrosinaasille S. castaneoglobisporus). Deoksisessa eli pelkistyneessä tilassa molemmat kupariatomit ovat hapetustilassa +1. Kuparin ja kuparin välinen etäisyys on 4,4 Å. Koordinaatioluvut ovat 4 CuA: lle (kolme histidiiniligandia ja koordinoiva vesimolekyyli) ja 3 CuB: lle (kolme histidiiniligandia). Koordinaatiopallo on vääristynyt Trigonaalinen pyramidi Cua: lle ja neliömäinen tasomainen CuB: lle (koordinointipaikka, jota met− tilassa oleva silloittava OH-on vapaana). Inhibiittorikompleksissa fenyylitiourean (PTU) kanssa kuparin ja kuparin välinen etäisyys kasvaa 4,2 Å: aan PTU: n rikkiatomin korvatessa met–tilan hydroksosillan. Kahden Kopperin koordinaatiopiirit pysyvät samanlaisina kuin met-tilan koordinaatiopiirit, mutta aktiivisen kohdan jäännöksissä tapahtuu konformaatiomuutoksia. Merkittävin muutos on Fe261: n aromaattisen renkaan kiertyminen (katekolioksidaasin numerointi).
verrattuna metet-tilaan koordinaatiojäämien paikat ovat pelkistetyssä tilassa vain hieman erilaiset, mikä viittaa melko jäykkään taskuun. Koordinaatiomuutokset liittyvät taskun kupariatomien liikkeisiin. Inhibiittorikompleksi osoittaa, että Phe261 sijaitsee aktiivisen kohdan yläpuolella kuin portti, joka pyörii inhibiittorin sitouduttua. Näin ollen substraatin pääsy katalyyttiseen metallikeskukseen näyttää olevan tämän ”porttijäännöksen” hallinnassa.
tyrosinaasin katalyyttistä mekanismia tutkivat ensin Solomon ym.178 Solomon ehdotti mekanismia sekä tyrosinaasin kresolaasi-että katekolaasiaktiivisuudelle (Kuva 25). Tämän mekanismin mukaan oksiditila on kresolaasiaktiivisuuden (sisäpiirin) alkupiste. Tämä tila esiintyy tyrosinaasin lepomuodossa noin 15%: n suhteessa (85%: n met-tilassa). Monofenolisubstraatti sitoutuu oksiditilaan ja monooksigenoituu o-difenoliksi. Tämä difenoli sitoutuu tämän jälkeen metatyrosinaasin kuparikeskukseen bidentaattisidontatilassa, jota on ehdotettu malliyhdisteen perusteella.188 Difenolisubstraatin hapettuminen johtaa dinukleaarisen kuparikeskuksen pelkistyneeseen tilaan. Pelkistyneen tilan uudelleenoksidaatio oxy-tilaan tapahtuu dioksigeenin hyökkäyksen seurauksena ja sulkee katalyyttisen syklin.
Kuva 25. Tyrosinaasin ja katekolioksidaasin kresolaasi-ja katekolaasiaktiivisuuden mekanismi kehittyi Solomonin ja coworkersin alustavan ehdotuksen178 perusteella ja mukaan lukien tuoreemmat tulokset.186,187 jäljennös teoksesta C. Gerdemann; C. Eicken; B. Krebs, Acc. Kemiaa. Res. 2002, 35, 183-191, American Chemical Societyn luvalla.
katekolaasiaktiivisuuden mekanismi (ulkoympyrä) alkaa oksi-ja met-tiloista. Difenolisubstraatti sitoutuu met-tilaan (esimerkiksi), minkä jälkeen substraatti hapettuu ensimmäiseksi kinoniksi ja muodostuu entsyymin pelkistynyt tila. Dioksigeenin sitoutuminen johtaa oksi-tilaan, johon toinen difenolimolekyyli hyökkää. Hapettuminen toiseen kinoniin muodostaa jälleen met-tilan ja sulkee katalyyttisen syklin.
vaihtoehtoisia reaktiomekanismeja ovat Kitajiman ja Morooka189: n ehdottama radikaalimekanismi sekä cu(III) – välituote, joka perustuu malliyhdisteiden mittauksiin.190 katekolioksidaasin ja PTU: n inhibiittorikompleksin kiderakenteen perusteella on ehdotettu substraatin monodentaattisidontaa katekolioksidaasille.180 radikaali mekanismi, kuten ehdotetaan mustekala vulgaris hemosyaniinin heikolle katekolaasiaktiivisuudelle, 191 on myös mahdollinen katekolioksidaasille, koska I. batatasin ja odg hemosyaniinin katekolioksidaasin välinen vahva rakenteellinen suhde on kuvattu edellä.
katekolioksidaasin ja tyrosinaasin selvää eroa ei ole vielä selitetty. Tyrosinaasin monofenolaasiaktiivisuuden lag-vaihe on havaittu ja tutkittu, ja sen on ehdotettu johtuvan siitä, että tyrosinaasin met-tila estyy tilapäisesti monofenolisubstraatin ylimäärän vuoksi (kuva 25).186 Monofenolaasiaktiivisuus kasvaa, kun difenolituote syrjäyttää monofenolin met-tyrosinaasista ja mahdollistaa katalyyttisen syklin jatkumisen. Katekolioksidaasi on eristetyssä muodossaan läsnä yksinomaan met-tilassa ja sitä inhiboi myös fenoli. Tämän vuoksi esitettiin, että Oxy-tilan puute on syy katekolioksidaasin puutteelliseen kresolaasiaktiivisuuteen. Koska oxy-katekolioksidaasi ei myöskään osoita mono-oksigenaasiaktiivisuutta, tämä selitys ei vaikuta täysin tyydyttävältä. Toinen mahdollinen syy on se, että monofenolien hapetuksessa välttämättömäksi ehdotetun Cua: n Pääsy 192: een on estetty katekolioksidaasin kiderakenteessa I. batatasta.