L’établissement d’un Test de Liaison Compétitive Identifiant les Différentes Caractéristiques des Épitopes Neutralisants du Virus de l’Hépatite E

Résumé

Vise : À confirmer les différentes caractéristiques des épitopes neutralisants spécifiques au génotype et courants du virus de l’hépatite E (VHE). Méthode: Un test de liaison compétitive a été établi avec des anticorps monoclonaux neutralisants communs au génotype (mAbs) 3G1 et 5G5 connus ainsi que des mAbs neutralisants spécifiques au génotype 2B1 et 4C5. Le recombinant HEV ORF2 p166W01 dérivé du génotype 1 et le p166Chn dérivé du génotype 4 ont été utilisés comme antigènes enrobés, afin de déterminer si les MAB reconnaissent des épitopes indépendants, similaires ou chevauchants. Les MAB ont été produits, purifiés et conjugués à la peroxydase de raifort (HRP). Le 2B1 conjugué au HRP ne pouvait réagir qu’avec le p166W01 mais pas le p166Chn, le 4C5 conjugué au HRP ne pouvait réagir qu’avec le p166Chn mais pas le p166W01, tandis que le 3G1 et le 5G5 conjugués au HRP pouvaient réagir à la fois avec le p166W01 et le p166Chn. Ainsi, des tests de liaison concurrentielle ont été réalisés successivement en utilisant l’antigène p166W01 et p166Chn. Résultats et conclusion: Les résultats d’essais de liaison concurrentiels ont révélé que la liaison du 2B1 conjugué HRP à p166W01 ne pouvait pas être inhibée par le 5G5 ou le 3G1. De même, la liaison du 4C5 conjugué HRP au p166Chn n’a pas pu être inhibée par le 5G5 ou le 3G1. Cependant, les mAbs 5G5 et 3G1 ont bloqué la liaison mutuelle avec p166W01 et p166Chn, suggérant que les mAbs neutralisants communs et spécifiques au génotype reconnaissent des épitopes indépendants.

©2018 S. Karger AG, Bâle

Introduction

Le virus de l’hépatite E (VHE) est un virus à ARN à brin positif non développé qui se transmet principalement par voie orale et provoque une hépatite E aiguë chez l’homme. L’infection par le VHE peut entraîner des pronostics préjudiciables, par exemple une défaillance de la vie, une hépatite aiguë sévère, une infection chronique dans l’organe transplanté et chez les patients immunodéprimés, et une mortalité élevée chez les femmes enceintes. En plus de l’infection confirmée chez l’homme, les VHE infectent également les animaux et peuvent être transmis des animaux aux êtres humains; l’incidence de l’infection par l’hépatite E dans les pays développés a également augmenté de manière significative. Ces résultats indiquent que le VHE constitue une menace pour la santé publique à travers le monde.

Bien qu’un sérotype ait été reconnu, les isolats de VHE, provenant de différentes régions du monde, pourraient être classés en 4 génotypes majeurs. Les VHE des génotypes 1 et 2 diffèrent des génotypes 3 et 4 par leurs caractéristiques épidémiologiques, antigéniques et immunogènes.

À ce jour, la recherche sur la caractérisation des épitopes antigéniques principalement basée sur la protéine structurale HEV pour un système de culture in vitro n’est pas disponible. pORF2 est la principale protéine structurale du VHE codée par ORF2, qui est 1 des 3 cadres de lecture ouverts (ORF) qui se chevauchent du génome viral. Des régions immunogènes prédominantes du pORF2 ont été localisées au niveau de la région C-terminale 2/3, qui étaient les principales cibles du développement du vaccin.

Notre étude précédente a révélé l’existence d’une différence d’immunogénicité entre le vaccin contre l’hépatite E p179 (439-617 acides aminés de la protéine ORF2) dérivé du génotype 4 et le vaccin p239 (Hécoline) dérivé du génotype 1, la différence pouvant être attribuée à la présence d’épitope(s) spécifique(s) au génotype HEV. Des anticorps monoclonaux (MAB) produits chez des souris immunisées respectivement avec du p166Sar (452-617 acides aminés de la protéine ORF2) dérivé du génotype 1 et du p166Chn dérivé du génotype 4 ont été utilisés pour confirmer la présence d’épitopes spécifiques au type ge. Outre 2 mAbs neutralisants communs au génotype, 3G1 et 5G5, 2 mAbs neutralisants spécifiques au génotype, 2B1 et 4C5, ont également été obtenus. 2B1 contre p166Sar pourrait se lier spécifiquement aux protéines recombinantes des génotypes 1 et 2 et ne neutraliser que les souches des génotypes 1 et 2 in vitro; 4C5 contre le p166Chn immunoréacté spécifiquement contre les protéines recombinantes des génotypes 3 et 4 et neutralisé uniquement les souches des génotypes 3 et 4, tandis que 3G1 contre le p166Sar et 5G5 contre le p166Chn pourraient se lier aux protéines recombinantes des génotypes 1-4 et neutraliser 4 souches du génotype. Pour une étude plus approfondie des différentes caractéristiques des épitopes neutralisants génotypiques communs et spécifiques au génotype du VHE, un test de liaison compétitive a été développé en utilisant les mAbs 2B1, 3G1, 4C5 et 5G5, afin de confirmer si les épitopes reconnus par les mAbs sont indépendants, similaires ou se chevauchent.

Matériaux et méthodes

Protéines recombinantes

La protéine recombinante p166 était une protéine tronquée de pORF2, les séquences nucléotidiques étaient dérivées des souches HEV suivantes: W01 (génotype 1, JX857689) et China-9829 (génotype 4, AY789225). Des plasmides recombinants ont été construits et exprimés dans Escherichia coli. Les 2 protéines p166 marquées par His ont été désignées comme p166W01 et p166Chn, respectivement.

Production de mAb

Un total de 4 MAB neutralisants, 2B1, 3G1, 4C5 et 5G5 décrits précédemment, ont été utilisés pour développer un test immuno-enzymatique compétitif (ELISA). 2B1 et 3G1 ont été soulevées contre p166Sar; 4C5 et 5G5 ont été soulevées contre p166Chn. Les MAB ont été produits en injectant 106 cellules d’hybridomes dans la cavité péritonéale d’une souris BALB/c; le liquide d’ascite contenant des MAB a été récolté après 7 à 10 jours, filtré, centrifugé et stocké à -80 °C.

Purification de mAbs

Le fluide d’ascite de mAb a été purifié par chromatographie d’affinité sur colonne de protéine G-sépharose (Sigma, Allemagne). Des fractions contenant des anticorps ont été collectées à l’aide du tampon d’élution acide (glycine-HCl 0,1 M, pH 2,8) à partir de la protéine G immobilisée puis déterminées à 280 nm ; l’absorbance à 280 nm (A280) peut être utilisée pour quantifier grossièrement les mAbs. L’électrophorèse sur gel de polyacrylamide de dodécylsulfate de sodium a été utilisée pour confirmer et quantifier les fractions purifiées à l’aide d’albumine sérique bovine.

Couplage de la peroxydase de raifort à des mAbs

Purifiés ont été dialysés contre un tampon carbonate/bicarbonate de 100 mM (pH 9,3) à 4°C pendant une nuit. Les anticorps ont été couplés à la peroxydase de raifort (HRP) selon les instructions du fabricant (KPL). Environ 1,5 mg de HRP a été mélangé à 0,5 mg de mAb dans 0,5 mL de volume total de tampon de conjugaison HRP, en agitant doucement à température ambiante pendant 1 h. Le mélange a été laissé à température ambiante pendant 15 min après avoir ajouté 10 µl de l’agent réducteur, puis 1 volume de glycérol distillé a été ajouté pour stockage et utilisation ultérieure.

Réactivité croisée des MAB conjugués HRP à l’antigène hétérologue p166

La méthode ELISA a été appliquée pour confirmer la réactivité croisée des MAB conjugués HRP avec l’antigène p166W01 et p166Chn. Brièvement, des puits de microplaques ont été enrobés de 100 ng de l’antigène p166W01 et p166Chn, respectivement, incubés pendant 2 h à 37 °C. Ceci a été suivi d’une élimination des antigènes enrobés; 200 µL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 0,1% d’albumine sérique bovine ont été ajoutés dans des puits, puis des microplaques ont été incubées à température ambiante sous agitation douce. Deux heures plus tard, le tampon de blocage a été jeté et les puits ont été lavés deux fois avec du PBS contenant 0,05% de Tween-20 (PBST). Des dilutions en série de 2 fois de MAB conjugués HRP allant de 1:400 à 1:25 600 dans du PBS de caséine à 1% ont été ajoutées dans des puits correspondants, suivies de 45 min d’incubation à 37 °C; la caséine PBS a été éliminée par lavage 5 fois avec du PBST. Un substrat liquide de tétraméthylbenzidine a été ajouté pour le développement de la couleur en vue d’une incubation à 37 ° C pendant 10 min. Enfin, la densité optique (DO) de chaque puits a été lue à 450 nm, avec une longueur d’onde de référence de 630 nm.

Détermination des titres d’antigène et de mAb

Les titres d’antigène et de MAB ont été déterminés à l’aide d’un ELISA. Initialement, des dilutions en série de 2 fois de MAB conjugués à la HRP allant de 1: 400 à 1: 25 600 dans du PBS de caséine à 1% ont été préparées, puis ajoutées à des puits pré-enduits de dilutions en série de l’antigène p166W01 ou p166Chn. Suivi d’une incubation de 45 min à 37°C, les MAB non liés ont été éliminés par lavage 5 fois avec du PBST. Un substrat liquide de tétraméthylbenzidine a été ajouté pour le développement de la couleur pendant une incubation de 10 min à 37°C. Enfin, la DO de chaque puits a été lue à 450 nm, avec une longueur d’onde de référence de 630 nm, pour déterminer la dilution en sous-saturation et a donné une DO d’environ 1,0 à 450 nm, avec une longueur d’onde de référence de 630 nm.

Test de liaison compétitive

Les différentes caractéristiques des épitopes neutralisants communs et spécifiques au génotype du VHE ont été étudiées à l’aide d’un test de liaison compétitive par paires établi avec des MABS neutralisants communs et spécifiques au génotype. Les méthodes étaient similaires aux procédures décrites ci-dessus, sauf que p166W01 et p166Chn ont été utilisés comme antigène de revêtement, respectivement, et des mélanges de mAb conjugué HRP à deux fois la concentration et une concentration saturée de mAb non conjugué ont été ajoutés aux puits enrobés. La DO a été mesurée à 450 nm, avec une longueur d’onde de référence de 630 nm. Le pourcentage d’inhibition a été calculé en utilisant la formule : 100 ×. La compétition a été jugée positive si le pourcentage d’inhibition était supérieur à 50%.

Résultats

Réactivité croisée des MAB conjugués HRP à l’antigène hétérologue p166

La méthode ELISA a été appliquée pour évaluer la réactivité croisée des MAB conjugués HRP aux antigènes p166W01 et p166Chn. Les résultats ont révélé que le 2B1 conjugué au HRP aux dilutions de 1:400 à 1:25 600 ne réagissait qu’avec le p166W01, mais pas avec le p166Chn, et le 4C5 conjugué au HRP aux dilutions de 1:400 à 1:25 600 ne réagissait qu’avec le p166Chn. En revanche, les 3G1 et 5G5 conjugués à la HRP à des dilutions de 1:400 à 1:25 600 ont bien réagi avec les 2 protéines p166 (Fig. 1). Ces observations étaient similaires aux résultats précédents, 2B1 et 4C5 sont des MAB spécifiques au génotype, tandis que 3G1 et 5G5 sont des MAB communes au génotype.

La détermination de l’antigène p166W01 et des titres mAb conjugués HRP pour le Test de liaison compétitive

L’antigène p166W01 a été utilisé pour établir le test de liaison compétitive des mAbs 2B1, 3G1 et 5G5; les titres appropriés des mAbs et de l’antigène ont été déterminés à l’aide d’ELISA. Comme le montre le tableau 1, après titrage carré, lorsque la dilution de l’antigène p166W01 était de 1:400, le 2B1 conjugué HRP était de 1:6 400, la valeur moyenne de DO était proche de 1,0. Pendant ce temps, comme le montre le tableau 2, lorsque la dilution de l’antigène était de 1: 400, la 5G5 conjuguée à la HRP et la 3G1 conjuguée à la HRP étaient respectivement de 1: 6 400 et de 1: 12 800, et la valeur moyenne de la DO était proche de 1,0.

Détermination de l’antigène p166Chn et des titres mAb conjugués HRP pour le Test de liaison compétitive

L’antigène p166Chn a été utilisé pour établir le test de liaison compétitive des mAbs 4C5, 3G1 et 5G5, les titres appropriés des mAbs et de l’antigène ont également été déterminés à l’aide d’ELISA. Comme le montre le tableau 3, après titrage carré, lorsque la dilution de l’antigène p166Chn était de 1: 800, le 4C5 conjugué HRP était de 1: 6 400 et la valeur moyenne de DO était proche de 1,0. Pendant ce temps, comme le montre le tableau 4, lorsque la dilution de l’antigène était de 1: 800, les dilutions du 5G5 conjugué HRP et du 3G1 conjugué HRP étaient respectivement de 1: 6 400 et de 1: 12 800; la valeur moyenne de la DO était proche de 1,0.

Inhibition de la liaison de mAbs à p166W01

Les résultats de l’inhibition sont présentés dans le tableau 5; la liaison du 2B1 conjugué HRP à l’antigène p166W01 a été inhibée par le 2B1 non conjugué avec une inhibition de 68%. Il n’y a pas eu d’inhibition significative entre 2B1 avec mAbs 5G5 et 3G1 (27 et 30%). Une inhibition plus complète a été obtenue à partir de mAbs hétérologues 3G1 et 5G5, car la liaison de HRP-3G1 à l’antigène a été inhibée par 5G5 avec une inhibition de 61%, la 5G5 conjuguée à la HRP à l’antigène a été inhibée par 3G1 avec une inhibition de 99%. La liaison de HRP-3G1 et de HRP-5G5 à l’antigène p166W01 était également presque complètement inhibée par elle-même (inhibition de 81 et 80%). Ces résultats suggèrent que 3G1 et 5G5 peuvent partager le même épitope ou un épitope qui se chevauche, mais 2B1 reconnaît probablement un épitope différent.

Inhibition de la liaison des mAbs au p166Chn

Les résultats de l’inhibition sont présentés dans le tableau 5: la liaison de HRP-4C5 au p166Chn a été inhibée par le 4C5 non conjugué avec une inhibition de 69%, il n’y a pas eu d’inhibition significative (25 et 30%) obtenue à partir des 2 autres mAbs non conjugués 3G1 et 4C5. Cependant, un taux d’inhibition plus élevé a été obtenu à partir de la liaison des mAbs 3G1 et 5G5 conjugués à la HRP à l’antigène, inhibée par les 5G5 et 3G1 non conjugués avec une inhibition de 65 et 76%. La liaison de la 3G1 conjuguée à la HRP et de la 5G5 conjuguée à la HRP à l’antigène p166Chn était également presque inhibée par elle-même. Ces résultats suggèrent également que 3G1 et 5G5 peuvent partager le même épitope ou un épitope qui se chevauche, tandis que 4C5 reconnaît probablement un épitope différent.

Discussion

Depuis que le nouveau VHE porcin a été isolé pour la première fois, des anticorps anti-VHE ont été rapportés chez de nombreux animaux, ont révélé une infection par le VHE chez les animaux et les êtres humains, et cela peut être transmis des animaux aux êtres humains. La réduction de la morbidité et de la mortalité liées à l’hépatite E dépendait de la prévention vaccinale et d’un diagnostic efficace. La connaissance des épitopes du VHE était essentielle à la préparation du vaccin et au développement du diagnostic. La détection d’anticorps spécifiques dans le sérum est l’une des principales méthodes de diagnostic, et il existe un nombre croissant de tests sérologiques pour la détection des anticorps. Cependant, les tests utilisés pour détecter des anticorps spécifiques varient considérablement en sensibilité. Certains tests diagnostiques commerciaux basés sur des antigènes de génotype 1 ou 2 ne permettent pas de détecter les anticorps sériques contre les isolats des génotypes 3 ou 4. On sait peu de choses sur les mécanismes sous-jacents à la non-conformité des différents tests diagnostiques.

À l’heure actuelle, un système de culture cellulaire in vitro n’est toujours pas disponible pour la recherche sur le VHE. Par conséquent, le pORF2 contenant la plupart des sites immunogènes a été largement utilisé pour l’étude immunologique du VHE, avec un caractère dépendant de la conformation. La base structurelle d’un immunogène pour obtenir des anticorps neutralisants et protecteurs est l’épitope neutralisant, qui est la cible principale du développement du vaccin contre l’hépatite E. Nous avons précédemment rapporté que la protéine p166, une protéine tronquée de pORF2, peut modéliser un ou des épitopes neutralisants du VHE, et que des anticorps levés contre le p166 pourraient neutraliser différents génotypes du VHE. De plus, le vaccin contre l’hépatite E p239 dérivé du VHE de génotype 1 s’est avéré efficace dans un essai clinique de phase 3 mené dans la province du Jiangsu, en Chine, où l’isolat épidémique de VHE est de génotype 4. Ces résultats ont révélé l’existence d’épitopes neutralisants communs dans les différents génotypes du VHE. Outre le ou les épitopes neutralisants courants, l’existence d’épitopes spécifiques au génotype a également été confirmée pour la préparation et la caractérisation du mAb.

Pour mieux identifier la caractérisation des épitopes neutralisants communs et spécifiques au génotype, le test d’inhibition compétitive a été établi avec des mAbs neutralisants communs, 3G1 et 5G5, et des mAbs neutralisants spécifiques au génotype, 2B1 et 4C5, pour étudier la liaison de la compétition à l’antigène p166W01 ou p166Chn et pour déterminer si les mAbs reconnaissent des épitopes indépendants, similaires ou se chevauchant.

Initialement, des fluides ascitiques de mAbs 3G1, 2B1, 5G5 et 4C5 ont été produits, purifiés et conjugués avec HRP. La méthode ELISA a été appliquée pour comparer l’af finité de liaison des MAB conjugués HRP avec différents génotypes de HEV p166. Les résultats ont révélé que HRP-conjugué ed 2B1 n’a réagi qu’avec le génotype 1 p166W01, mais pas avec le p166Chn. De même, le 4C5 conjugué HRP ne réagit qu’avec le p166Chn. En revanche, les 3G1 et 5G5 conjugués à la HRP ont bien réagi contre les 2 protéines du génotype p166. Ainsi, les tests de liaison concurrentielle sont basés sur les antigènes de génotype 1 et 4 HEV p166. Les résultats des tests de liaison concurrentiels ne sont pas surprenants, c’est-à-dire que la liaison de 2B1 à p166W01 n’était en compétition que par elle-même, tandis que 3G1 et 5G5 pouvaient se concurrencer pour la liaison à p166W01. De plus, la liaison de 4C5 à p166Chn n’était également concurrencée que par elle-même, mais 3G1 et 5G5 pouvaient se concurrencer pour la liaison à p166Chn. Ces résultats ont indiqué que les épitopes 3G1 et 5G5 reconnaissent les mêmes épitopes ou se chevauchent et que les épitopes 2B1 et 4C5 reconnaissent des épitopes différents.

Il s’agit de la première étude qui étudie les différentes caractéristiques des épitopes neutralisants conformationnels génotypiques communs et spécifiques au génotype du VHE. Nous avons démontré que les épitopes neutralisants communs et spécifiques au génotype peuvent être indépendants. Cette découverte est très bénéfique pour démontrer les mécanismes sous-jacents à la faible concordance des différents tests diagnostiques. D’autres études sont d’une importance cruciale pour élucider les différentes caractéristiques des épitopes neutralisants du VHE dans l’efficacité du développement diagnostique et de la préparation du vaccin.

Reconnaissance

Ce travail a été soutenu par la fondation pour la recherche scientifique doctorale de l’Université médicale d’Anhui (n ° 0110037101).

Déclaration de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

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