La toxine B de Clostridium difficile
Lorsque le résidu de thréonine catalytique de la glucosyltransférase désactive une famille de petites GTPases, par exemple la famille Rho; Rac et Cdc42 à l’intérieur des cellules cibles perturbent les mécanismes de transduction du signal, ce qui entraîne un dysfonctionnement du cytosquelette d’actine, de la jonction cellule-cellule et de l’apoptose (Fig. 5). Rho induit l’activité des fibres de stress d’actine. Les protéines Rac contrôlent les activités de l’ébouriffage membranaire et de la NADPH-oxydase neutrophile. Cdc42 régule la formation de filaments de F-actine chez les filopodes.
Cytotoxicitémodifier
Figure 3: La toxine B modifie la dynamique de la structure cellulaire. Images de SEM: a) cellules de contrôle et b) cellules traitées avec TcdB pendant 18 heures. La flèche noire indique l’emplacement du blébulage de la surface cellulaire.
Plusieurs études ont démontré que la présence de TcdB dans les cellules de mammifères entraîne des changements rapides dans la morphologie cellulaire et la signalisation cellulaire. En peu de temps, les cellules ont l’apparence d’une plaque avec de petites doses de TcdB et de TcdA. De plus, la mort des cellules est un impact majeur de ces toxines après que les cellules ont été intoxiquées. Une enquête de Donta et coll., transmis que la TcdB a de graves impacts sur d’autres cellules de mammifères telles que les cellules ovariennes de hamster chinois, les cellules épithéliales cervicales humaines, les cellules surrénales de souris, les hépatocytes de rat et les astrocytes de rat (Fig.3).
L’activité cytotoxique est basée sur les types cellulaires, qui peuvent varier de 4 à 200 fois. Généralement, lorsque les cellules sont infectées par la TcdB, elles perdent non seulement leur intégrité structurelle, mais aussi des diminutions de filaments de F-actine. Les arrondis des cellules par TcdB ne prennent pas plus de 2 heures (Fig. 4), mais en ce qui concerne la mort cellulaire, cela peut prendre environ 24 heures. En ce qui concerne la diarrhée associée à Clostridium difficile (CDAD), les effets de la cytopathicité sont plus critiques que la mort cellulaire réelle car une fois que les cellules perdent l’intégrité du filament d’actine du cytosquelette, elles perdent également sa fonction normale.
Figure 4 : Effets de la toxine B sur les astrocytes de rat. Il s’agit d’une illustration probable d’astrocytes de rat incubés avec 100 ng/ml de toxine B pendant 2 heures à 37 °C.
Effets sur les petites GTPASESMODIFIER
La cause de l’activité cytotoxique de la TcdB dans la cellule hôte est principalement médiée par l’endocytose des récepteurs. Les endosomes acides permettent à la toxine B d’entrer dans le cytosol. Ce phénomène se produit par une région de récepteur de liaison, qui permet à la toxine de pénétrer dans les cellules hôtes. Grâce à l’accessibilité du cytosol des cellules hôtes, TcdB désactive les petites GTPases (Fig. 5), par exemple les membres de la famille Rho Rac et Cdc42 par le processus de glycosylation de la thréonine 35 dans Cdc42 et Rac, et de la thréonine 37 dans Rho. Ces Rho GTPases se trouvent de manière ubiquitaire dans le cytosol des cellules eucaryotes responsables de l’organisation du cytosquelette d’actine car les toxines présentes dans le cytosol provoquent la condensation des filaments d’actine à la suite de l’arrondi cellulaire et du blébinage membranaire (Fig. 3), ce qui conduit finalement à l’apoptose. TcdB provoque des changements critiques dans la dynamique et la morphologie des cellules. La figure 3 montre l’effet probable de la toxine B sur la surface d’une cellule; blébulisation membranaire (flèches noires). De plus, TcdB inactive les GTPases Rho. En conséquence, les jonctions cellule-cellule sont perturbées, ce qui améliore la perméabilité épithéliale de la toxine B et l’accumulation de liquide dans la lumière. C’est l’un des principaux agents responsables de la diarrhée associée à Clostridium difficile (CDAD) (Fig. 5).
Figure 5 : Modifications intracellulaires par TcdB. Premièrement, la toxine B se lie à la surface de la cellule et est internalisée par une endocytose médiée par les récepteurs. Deuxièmement, l’acidification de l’endosome déclenche la formation d’un pore à travers lequel le GTD est translocalisé. Troisièmement, l’absorption par l’UDP-glucose aide à se lier aux GTPases et à se libérer dans le cytosol. Enfin, le GTD glucosylate les GTPases de la famille des Rho au niveau de la membrane cellulaire et contrôle la régulation de la transcription et finalement l’apoptose de la cellule.
De plus, le taux d’hydrolyse par TcdB de l’UDP-glucose est environ cinq fois supérieur au TcdA. Plusieurs études ont indiqué que Rho présente une modification post-traductionnelle par prénylation et carboxyméthylation, qui se produit dans le côté cytoplasmique de la membrane plasmique, d’où l’échange de GTP en GDP. Lorsque la TcdB se lie à la Rho et à d’autres petites GTPases, la GTP s’hydrolyse en GDP, ce qui conduit à la liaison GTP (active) à la liaison GDP (inactive) (Fig. 5). De plus, cette activité d’échange est régulée par des facteurs de guanine dans le cytosol de la cellule.
Perturbation sur les voies de signalmodifier
La régulation cellulaire de Rho, Rac et Cdc42 a des effets en dehors du voisinage des filaments d’actine du cytosquelette (Fig. 4), Ces petites GTPases sont incorporées dans le cycle cellulaire qui régule les signaux via des kinases de protéines kinases activées par les mitogènes (MAPKKs). Certaines parties physiologiques des cellules qui ne sont pas impliquées dans les filaments d’actine peuvent ne pas provoquer d’arrondi cellulaire ou de mort cellulaire tout de suite, mais dans l’activité de la voie en aval, peuvent entraîner la détérioration des filaments d’actine et enfin, la mort cellulaire.
En 1993, une étude menée par Shoshan et al., a montré que les cellules avec TcdB modifiaient l’activité de la phospholipase A2. C’était un événement indépendant de la perturbation du cytosquelette d’actine. Shoshan et coll., a également montré que TcdB inhibait l’activité de signalisation du récepteur en désactivant les protéines Rho via la phospholipase D.
Formation de poredit
TcdB accède à l’intérieur de la cellule par une endocytose médiée par la clathrine, Lorsque la toxine B fait partie du cytosol, la glucosyltransférase traverse la membrane endosomale, ce qui diminue le pH, induit une translocation et conduit finalement à des modifications morphologiques des résidus de région de translocation (958-1130). Les régions hydrophobes sont intégrées dans la membrane hôte pour former des pores qui permettent aux domaines glucosyltransférases de passer à travers. Lorsque les cellules sont infectées par le TcdB dans un environnement acide, il atténue les toxines et provoque des réarrangements de forme (Fig. 6). En conséquence du pH acide, le TcdB présente des différences claires dans la fluorescence originale du tryptophane, la susceptibilité des protéases et les surfaces hydrophobes. Un autre groupe a montré que l’acidification entraîne des changements conformationnels de la toxine et, plus important encore, aide à former des pores. Une région de translocation putative (Fig. 2) représente environ 801-1400 acides aminés, dont les résidus 958-1130 sont hydrophobes et sont responsables de la formation de pores transmembranaires. La majorité des études ont utilisé la souche TcdB 630 pour montrer l’activité de formation des pores des toxines de C. difficile.
Induite par pHEdit
Pour voir si les effets du clivage protéolytique de la TcdB ont lieu à la surface cellulaire ou dans les endosomes acides, les études ont utilisé la bafilomycine A1, connue pour bloquer les ATPases H +-de type v des endosomes. Cela réduit l’acidité dans les endosomes. La voie d’absorption physiologique de la TcdB empêche l’activité cytopathique de la TcdB. Lorsque les cellules étaient dans des conditions acides (pH 4,0) pendant 5 minutes après la liaison du TcdB à la surface des cellules à 37 degrés Celsius, les réarrangements de forme et les arrondis ont été observés. Cependant, lorsque des cellules arrondies ont été incubées pendant une heure supplémentaire à pH neutre (7,0) avec des paramètres similaires, aucun arrondi cellulaire n’a été observé. Les deux études ont montré que la toxine B a une propriété de clivage protéolytique, ce qui est essentiel pour l’accès au cytosol. Le pH acide de l’endosome entraîne des altérations topologiques de la TcdB (Figure 6).
Figure 6: Domaine d’organisation de TcdB.Montrant la différence entre le pH neutre et acide (4).
GénétiquEdit
Le gène codant pour la protéine TcdB, tcdB, est situé dans la région chromosomique de 19,6 kb. C’est ce qu’on appelle le locus de pathogénicité ou PaLoc (Figure 2). Le cadre de lecture ouvert (ORF) pour tcdB est de 7 098 nucléotides de longueur. Il est important de mentionner que — outre les principaux gènes de toxine dans la région PaLoc – il existe trois autres gènes accessoires qui codent dans la région PaLoc: tcdR (L), tcdC (R) et tcdE au milieu. Ces gènes aident à réguler l’expression de TcdA et de TcdB. Ils aident également à sécréter ou à libérer les toxines de la cellule. Le gène codant tcdE, situé entre tcdB et tcdA, est analogue aux protéines holines, ainsi, il est suggéré que tcdE fonctionne comme un gène facilitateur qui améliore la libération ou la sécrétion de TcdA et de TcdB augmentant par conséquent la perméabilité de la membrane cellulaire hôte.
Figure 2: Locus de pathogénicité archétypique (PaLoc), codant les grandes toxines clostridiales (LCT) impliquées dans C. infections difficiles CDI.
Détection des toxinesdit
Il existe différentes tailles de plasmides de C. difficile. Les poids moléculaires détectés varient de 2,7×106 à 100×106, mais la taille des plasmides ne montre aucune corrélation avec la toxicité. Afin de détecter le taux de toxine B chez C. difficile, les cliniciens utilisent largement des tests de culture cellulaire dérivés d’échantillons de selles de patients atteints de CMP. Le test de culture cellulaire est considéré comme un « étalon-or » pour la détection de la toxicité chez C. difficile car une petite quantité de toxine B est capable de provoquer un arrondi cellulaire (Fig. 4), c’est donc un avantage majeur des laboratoires cliniques d’établir des corrélations avec le CDAD provoqué par la TcdB. Bien que l’activité cytotoxique des grandes toxines clostridiales (LCT) ait été trouvée dans des échantillons de selles de patients atteints de CMP, l’activité de la toxine B a eu des effets cytotoxiques plus néfastes que la toxine A. Par conséquent, l’activité de la toxine A est atténuée lorsqu’elle n’est pas isolée de la toxine B. La détection de la toxicité de C. difficile est extrêmement sensible, cependant, l’utilisation du test de culture cellulaire permet aux laboratoires cliniques de surmonter le défi; l’utilisation de doses aussi faibles que 1 pg / mL de toxine B est suffisante pour provoquer un arrondi cellulaire. C’est l’avantage majeur de l’utilisation du test de tissus de culture pour détecter la toxicité chez les patients atteints de CMP. Même si les laboratoires cliniques ont essayé d’utiliser un dosage immuno-absorbant enzymatique à plaques de microtitres (ELISA) et d’autres techniques pour détecter l’activité cytotoxique de la toxine B dans les fèces des patients atteints de CMP, les résultats ne sont pas aussi précis que ceux où des tests de culture cellulaire ont été utilisés.
Facteur de productionmodifier
En ajoutant un antimicrobien, p.ex. des études sur la clindamycine, dans le milieu de croissance de la culture, ont montré que l’activité cytotoxique dans les cultures de C. difficile augmente de 4 à 8 fois. De plus, connaissant le rôle des antibiotiques sur les causes de la CMP, de nombreuses études antérieures se sont concentrées sur les effets de la production antimicrobienne de toxines. Par conséquent, des études ont permis de conclure que la nature subinhibitoire des niveaux de vancomycine et de pénicilline augmentait la production de toxines dans les cultures de C. difficile. Les quantités de production de toxines étaient corrélées avec l’utilisation du milieu de croissance pour les organismes. Une autre étude a montré que les niveaux élevés de production de toxines de TcdB ont été observés dans des milieux complexes tels que le bouillon de perfusion cérébral et cardiaque. Des niveaux élevés de toxines ont été produits avec isolement de très virulents. Inversement, de faibles niveaux de toxines ont été produits avec isolement de faiblement virulents. Ainsi, il montre que les productions de toxines étaient co-régulées. Bien que le mécanisme derrière l’implication de l’environnement dans la modulation des signaux exprimant les toxines ne soit pas compris, des études in vitro ont montré que l’expression de la toxine est renforcée par la répression des catabolites et le stress, par exemple les antibiotiques. Une autre étude a montré que la limitation de la biotine dans un milieu bien caractérisé augmente la production de TcdB de 64 fois et de TcdA de 35 fois. Cela a été fait avec C. difficile et des doses de biotine aussi petites que 0,05 nM. Plusieurs autres premières études ont soutenu la théorie selon laquelle la production de toxine a quelque chose à faire face au stress ou à la répression catabolite de la toxine TcdA ou TcdB. De plus, de nombreuses études indiquent que la principale raison des différences entre les autres études est due à la production de toxines qui ne se produit pas avec tous les isolats de C. difficile.