Protéinase K
Activée par le calcium, l’enzyme digère préférentiellement les protéines après des acides aminés hydrophobes (acides aminés aliphatiques, aromatiques et autres hydrophobes). Bien que les ions calcium n’affectent pas l’activité enzymatique, ils contribuent à sa stabilité.Les protéines seront complètement digérées si le temps d’incubation est long et la concentration en protéase suffisamment élevée. Lors de l’élimination des ions calcium, la stabilité de l’enzyme est réduite, mais l’activité protéolytique reste. La protéinase K possède deux sites de liaison pour le Ca2+, situés à proximité du centre actif, mais qui ne sont pas directement impliqués dans le mécanisme catalytique. L’activité résiduelle est suffisante pour digérer les protéines, qui contaminent généralement les préparations d’acides nucléiques. Par conséquent, la digestion avec la Protéinase K pour la purification des acides nucléiques est généralement effectuée en présence d’EDTA (inhibition des enzymes dépendantes des ions métalliques telles que les nucléases).
La protéinase K est également stable sur une large plage de pH (4-12), avec un pH optimal de pH 8,0.Une élévation de la température de réaction de 37 ° C à 50-60 ° C peut augmenter l’activité plusieurs fois, comme l’addition de dodécylsulfate de sodium (SDS) à 0,5–1% ou de chlorure de Guanidinium (3 M), de thiocyanate de Guanidinium (1 M) et d’urée (4 M). Les conditions mentionnées ci-dessus améliorent l’activité de la protéinase K en rendant ses sites de clivage du substrat plus accessibles. Des températures supérieures à 65 ° C, l’acide trichloracétique (TCA) ou les inhibiteurs de la protéase sérine AEBSF, PMSF ou DFP inhibent l’activité. La protéinase K ne sera pas inhibée par le chlorure de Guanidinium, le thiocyanate de Guanidinium, l’urée, le Sarkosyle, le Triton X-100, le Tween 20, le SDS, le citrate, l’acide iodoacétique, l’EDTA ou par d’autres inhibiteurs de la sérine protéase comme la Na-Tosyl-Lys Chlorométhyl Cétone (TLCK) et la Na-Tosyl-Phe Chlorométhyl Cétone (TPCK).
Activité de la protéase K dans les tampons couramment utilisés
| Tampon (pH = 8,0, 50 °C, 1,25 µg/mL protéase K, incubation de 15 min) | Activité de la protéinase K (%) |
|---|---|
| 30 mM Tris * Cl | 100 |
| 30 mM Tris* Cl; 30 Mm EDTA; 5% Tween 20; 0,5% Triton X-100; 800 mm GuHCl | 313 |
| 36 mM Tris* Cl; 36 mm EDTA; 5% Tween 20; 0,36% Triton X-100; 735 mm GuHCl | 301 |
| 10 mM Tris* Cl; 25 mm EDTA; 100 mm NaCl; 0,5% SDD | 128 |
| 10 MM Tris* Cl; 100 mm EDTA; 20 mm NaCl; 1% Sarkosyle | 74 |
| 10 mM Tris * Cl; 50 mm KCl; 1,5 mm MgCl2; 0,45% Tween 20; 0,5% Triton X-100 | 106 |
| 10 mM Tris* Cl; 100 mm EDTA; 0.5% SDS | 120 |
| 30 mM Tris·Cl; 10 mM EDTA; 1% SDS | 203 |