Purification des protéines
Le choix d’un matériau de départ est la clé de la conception d’un processus de purification. Chez une plante ou un animal, une protéine particulière n’est généralement pas distribuée de manière homogène dans tout le corps; différents organes ou tissus ont des concentrations plus ou moins élevées de la protéine. L’utilisation uniquement des tissus ou organes les plus concentrés diminue les volumes nécessaires à la production d’une quantité donnée de protéines purifiées. Si la protéine est présente en faible abondance ou si elle a une valeur élevée, les scientifiques peuvent utiliser la technologie de l’ADN recombinant pour développer des cellules qui produiront de grandes quantités de la protéine désirée (c’est ce qu’on appelle un système d’expression). L’expression recombinante permet de marquer la protéine, par exemple par une étiquette His ou une étiquette Strep pour faciliter la purification, réduisant ainsi le nombre d’étapes de purification requises.
Une purification analytique utilise généralement trois propriétés pour séparer les protéines. Tout d’abord, les protéines peuvent être purifiées en fonction de leurs points isoélectriques en les faisant passer à travers un gel gradué de pH ou une colonne échangeuse d’ions. Deuxièmement, les protéines peuvent être séparées en fonction de leur taille ou de leur poids moléculaire par chromatographie d’exclusion de taille ou par analyse SDS-PAGE (électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide). Les protéines sont souvent purifiées à l’aide de la PAGE 2D et sont ensuite analysées par empreinte de masse peptidique pour établir l’identité de la protéine. Ceci est très utile à des fins scientifiques et les limites de détection des protéines sont aujourd’hui très faibles et les quantités de nanogrammes de protéines sont suffisantes pour leur analyse. Troisièmement, les protéines peuvent être séparées par polarité / hydrophobicité via une chromatographie liquide à haute performance ou une chromatographie en phase inversée.
Habituellement, un protocole de purification des protéines contient une ou plusieurs étapes chromatographiques. La procédure de base en chromatographie consiste à faire circuler la solution contenant la protéine à travers une colonne remplie de divers matériaux. Différentes protéines interagissent différemment avec le matériau de la colonne, et peuvent ainsi être séparées par le temps nécessaire pour passer la colonne, ou les conditions requises pour éluer la protéine de la colonne. Habituellement, les protéines sont détectées lorsqu’elles sortent de la colonne par leur absorbance à 280 nm. De nombreuses méthodes chromatographiques différentes existent:
Chromatographie d’exclusion de taille
La chromatographie peut être utilisée pour séparer les protéines en solution ou en conditions de dénaturation en utilisant des gels poreux. Cette technique est connue sous le nom de chromatographie d’exclusion de taille. Le principe est que les molécules plus petites doivent traverser un volume plus important dans une matrice poreuse. Par conséquent, les protéines d’une certaine taille nécessiteront un volume variable d’éluant (solvant) avant d’être collectées à l’autre extrémité de la colonne de gel.
Dans le cadre de la purification des protéines, l’éluant est généralement mis en commun dans différents tubes à essai. Tous les tubes à essai ne contenant aucune trace mesurable de la protéine à purifier sont jetés. La solution restante est donc constituée de la protéine à purifier et de toute autre protéine de taille similaire.
Séparation basée sur la charge ou l’hydrophobie
Chromatographie d’interaction hydrophobe
Le milieu HIC est amphiphile, avec des régions hydrophobes et hydrophiles, permettant la séparation des protéines en fonction de leur hydrophobie de surface. Les protéines cibles et leurs espèces agrégées de produits ont tendance à avoir des propriétés hydrophobes différentes et leur élimination via HIC purifie davantage la protéine d’intérêt. De plus, l’environnement utilisé utilise généralement des conditions de dénaturation moins dures que les autres techniques de chromatographie, aidant ainsi à préserver la protéine d’intérêt dans son état natif et fonctionnel. Dans l’eau pure, les interactions entre la résine et les régions hydrophobes de la protéine seraient très faibles, mais cette interaction est renforcée par l’application d’un échantillon de protéine à la résine HIC dans un tampon à haute résistance ionique. La force ionique du tampon est alors réduite pour éluer des protéines par ordre d’hydrophobicité décroissante.
Chromatographie d’échange d’ionsmodifier
La chromatographie d’échange d’ions sépare les composés en fonction de la nature et du degré de leur charge ionique. La colonne à utiliser est sélectionnée en fonction de son type et de sa force de charge. Les résines échangeuses d’anions ont une charge positive et sont utilisées pour retenir et séparer les composés chargés négativement (anions), tandis que les résines échangeuses de cations ont une charge négative et sont utilisées pour séparer les molécules chargées positivement (cations).
Avant le début de la séparation, un tampon est pompé à travers la colonne pour équilibrer les ions chargés opposés. Lors de l’injection de l’échantillon, les molécules de soluté échangeront avec les ions tampons car chacune est en compétition pour les sites de liaison sur la résine. La durée de rétention de chaque soluté dépend de la force de sa charge. Les composés les plus faiblement chargés éluteront en premier, suivis de ceux avec des charges successivement plus fortes. En raison de la nature du mécanisme de séparation, le pH, le type de tampon, la concentration du tampon et la température jouent tous des rôles importants dans le contrôle de la séparation.
La chromatographie par échange d’ions est un outil très puissant pour la purification des protéines et est fréquemment utilisée dans les séparations analytiques et préparatives.
Électrophorèse à écoulement gratuitmodifier
L’électrophorèse à flux libre (FFE) est une technique d’électrophorèse sans support qui permet la séparation préparative des protéines dans un flux tampon laminaire en utilisant un champ électrique orthogonal. En utilisant un gradient de pH, qui peut par example être induit par des ampholytes, cette technique permet de séparer les isoformes protéiques jusqu’à une résolution < 0,02 delta-pI.
Chromatographie d’affinitémodifier
La chromatographie d’affinité est une technique de séparation basée sur la conformation moléculaire, qui utilise fréquemment des résines spécifiques à l’application. Ces résines ont des ligands attachés à leurs surfaces qui sont spécifiques des composés à séparer. Le plus souvent, ces ligands fonctionnent de manière similaire à celle des interactions anticorps-antigène. Cet ajustement « serrure et clé » entre le ligand et son composé cible le rend très spécifique, générant fréquemment un seul pic, alors que tout le reste de l’échantillon n’est pas retenu.
De nombreuses protéines membranaires sont des glycoprotéines et peuvent être purifiées par chromatographie d’affinité de lectine. On peut laisser les protéines solubilisées dans un détergent se lier à une résine de chromatographie qui a été modifiée pour avoir une lectine attachée de manière covalente. Les protéines qui ne se lient pas à la lectine sont éliminées, puis des glycoprotéines spécifiquement liées peuvent être éluées en ajoutant une forte concentration d’un sucre qui entre en concurrence avec les glycoprotéines liées au site de liaison de la lectine. Certaines lectines ont une liaison d’affinité élevée aux oligosaccharides de glycoprotéines difficiles à concurrencer les sucres, et les glycoprotéines liées doivent être libérées en dénaturant la lectine.
Chromatographie d’immunoaffinité
La chromatographie d’immunoaffinité utilise la liaison spécifique d’un anticorps-antigène pour purifier sélectivement la protéine cible. La procédure consiste à immobiliser une protéine sur un substrat solide (par exemple, une perle poreuse ou une membrane), qui se lie ensuite sélectivement à la cible, pendant que tout le reste s’écoule. La protéine cible peut être éluée en modifiant le pH ou la salinité. Le ligand immobilisé peut être un anticorps (comme l’immunoglobuline G) ou une protéine (comme la protéine A). Parce que cette méthode n’implique pas d’ingénierie dans une étiquette, elle peut être utilisée pour des protéines de sources naturelles.
Purification d’une protéine étiquetéedit
Une autre façon d’étiqueter les protéines consiste à créer une étiquette peptidique antigénique sur la protéine, puis à purifier la protéine sur une colonne ou en incubant avec une résine lâche recouverte d’un anticorps immobilisé. Cette procédure particulière est connue sous le nom d’immunoprécipitation. L’immunoprécipitation est tout à fait capable de générer une interaction extrêmement spécifique qui se traduit généralement par la liaison uniquement de la protéine désirée. Les protéines marquées purifiées peuvent ensuite être facilement séparées des autres protéines en solution et ensuite éluées en solution propre.
Lorsque les balises ne sont plus nécessaires, elles peuvent être clivées par une protéase. Cela implique souvent l’ingénierie d’un site de clivage de la protéase entre l’étiquette et la protéine.
HPLCEdit
La chromatographie en phase liquide à haute performance ou la chromatographie en phase liquide à haute pression est une forme de chromatographie appliquant une pression élevée pour conduire les solutés à travers la colonne plus rapidement. Cela signifie que la diffusion est limitée et que la résolution est améliorée. La forme la plus courante est la CLHP « phase inversée », où le matériau de la colonne est hydrophobe. Les protéines sont éluées par un gradient de quantités croissantes d’un solvant organique, tel que l’acétonitrile. Les protéines éluent en fonction de leur hydrophobie. Après purification par CLHP, la protéine est dans une solution qui ne contient que des composés volatils, et peut facilement être lyophilisée. La purification par CLHP entraîne fréquemment une dénaturation des protéines purifiées et n’est donc pas applicable aux protéines qui ne se replient pas spontanément.