Qu’est-ce que le Southern Blot ?

Par Hannah Simmons, M.Sc. Revu par Kate Anderton, B.Sc . (Éditeur)

Le blot est le processus par lequel de l’ADN, de l’ARN ou des protéines sont transférés sur une membrane afin d’être visualisés.

Crédit: Paul Cowan / .com

La première de ces méthodes était le Southern Blot, développé en 1975 par Edward Southern, et est utilisé pour détecter la séquence de fragments d’ADN. Depuis lors, deux autres méthodes ont été développées, appelées Blot Nord et Western. Ce sont des processus qui sont utilisés pour identifier les séquences d’ARN et de protéines, respectivement.

Méthodologie de Southern blot

Les fragments d’ADN sont initialement générés avec des enzymes de restriction et séparés par taille dans un processus appelé électrophorèse sur gel. L’alcaline est ensuite utilisée pour dénaturer l’ADN à double brin, formant des brins simples. L’ADN est ensuite transféré sur une feuille de nitrocellulose ou de nylon en plaçant une membrane sur le gel et en utilisant le flux de tampon pour encourager le mouvement de l’ADN du gel vers la membrane.

L’écoulement capillaire et le transfert sous vide sont les deux méthodes les plus couramment utilisées pour transférer les fragments d’ADN. En écoulement capillaire, le gel est placé au-dessus du niveau du tampon sur un bloc de support avec une membrane placée sur le dessus. Une pile de serviettes absorbantes est ensuite placée sur la membrane et est utilisée pour absorber le tampon sous le gel, soulevant les fragments d’ADN sur la membrane.

Par transfert sous vide, la membrane est placée sous le gel et les deux sont immergées dans du tampon. Un vide est ensuite utilisé pour créer un flux qui tire les fragments d’ADN vers le bas sur la membrane.

Le chauffage ou le rayonnement UV sont ensuite utilisés pour s’assurer que les fragments d’ADN restent attachés à la membrane en permanence, tout en maintenant la disposition spécifique de l’ADN. Des sondes marquées à simple brin sont ensuite utilisées pour se lier aux séquences cibles.

La feuille est incubée avec ces sondes et seules les sondes complémentaires se lient. Les sondes non complémentaires sont ensuite lavées de la membrane, en veillant à ce qu’il ne reste que les sondes liées. Ces sondes peuvent ensuite être détectées par autoradiographie pour révéler le motif d’hybridation sur un film radiographique.

Applications du Southern blot

Le Southern blot a de nombreuses utilisations différentes. Premièrement, les réarrangements génétiques peuvent être analysés. Par exemple, en immunologie, cette méthode peut être utilisée pour identifier les réarrangements clonaux des gènes des récepteurs des lymphocytes T. Deuxièmement, des fragments spécifiques d’ADN peuvent être identifiés à partir d’un mélange de nombreux autres fragments.

D’autres exemples d’utilisation incluent à la fois le polymorphisme de longueur de fragment de restriction (RFLP) et l’analyse de répétition en tandem à nombre variable (VNTR). RFLP utilise les différences de longueur des séquences d’ADN homologues pour cartographier les génomes et peut être utilisé dans les tests médico-légaux et de paternité.

L’analyse VNTR utilise les différences de longueur des séquences nucléotidiques répétées pour former une empreinte ADN, une méthode couramment utilisée dans les tests de paternité et les tests médico-légaux.

Ces méthodes peuvent également être utilisées dans le diagnostic de maladies causées par une mutation, par exemple l’anémie falciforme. Cette affection génétique est due à un polymorphisme nucléotidique unique (A à T) dans le gène de la bêta-globine, entraînant une hémoglobine anormale.

Southern blot pour le syndrome de l’X fragile

Les Southern blots ont été largement utilisés pour aider à identifier les gènes avec des régions de répétition amplifiées. Ce sont des séquences courtes et répétitives dans l’ADN qui ne codent pas les produits géniques. Un exemple où le southern blot peut être utile est dans le diagnostic du syndrome de l’X fragile. Cette condition génétique est due à l’augmentation de la région de répétition CGG/ CCG située dans le gène FMR1.

Ce gène contient généralement entre 5 et 40 régions répétées. Les individus avec 55-200 répétitions ont une prémutation du gène FMR1, et les individus avec > 200 répétitions ont le syndrome de l’X fragile. L’augmentation des répétitions conduit à la méthylation du gène, ce qui inhibe la transcription et empêche la production de la protéine FMRP. Cette protéine est nécessaire au fonctionnement normal du système nerveux, donc la perte de la fonction protéique entraîne les symptômes du syndrome de l’X fragile.

Dans le diagnostic, l’enzyme de restriction sensible à la méthylation EclX1 et l’enzyme insensible à la méthylation EcoR1 sont utilisées pour permettre la différenciation des allèles méthylés et des allèles non méthylés. Les allèles méthylés ne sont coupés qu’une seule fois pour donner un fragment d’ADN singulier de 5,1 kb.

Cependant, les allèles non méthylés sont coupés deux fois, produisant un fragment de 2,8 kb. Les répétitions de prémutation non méthylées (< 200) peuvent donc être distinguées des répétitions de mutation méthylées d’environ 200 répétitions, car le southern blot peut être utilisé pour identifier les tailles des fragments d’ADN.

Perspectives d’avenir

Dans l’ensemble, le Southern blot est une méthode importante pour le diagnostic et l’étude de maladies (telles que le syndrome de l’X fragile et l’anémie falciforme) et l’analyse de l’ADN pour d’autres raisons (telles que les tests médico-légaux et de paternité).

Cependant, le southern blot est très complexe techniquement, coûteux, laborieux et nécessite une grande quantité d’échantillon d’ADN. De nouvelles méthodes remplacent donc lentement le southern blot, par example la PCR en temps réel. Ce processus est beaucoup plus facile et plus rapide que le southern blot et ne nécessite qu’un très petit volume d’ADN.

Pour en savoir plus

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• Qu’est-ce que la génétique?
• Histoire de la génétique
• Génétique et Expression des gènes
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Écrit par

Hannah Simmons

Hannah est une écrivaine en médecine et en sciences de la vie avec une maîtrise en sciences (M.Sc .) diplôme de l’Université de Lancaster, Royaume-Uni. Avant de devenir écrivain, les recherches d’Hannah se sont concentrées sur la découverte de biomarqueurs pour la maladie d’Alzheimer et la maladie de Parkinson. Elle a également travaillé à élucider davantage les voies biologiques impliquées dans ces maladies. En dehors de son travail, Hannah aime nager, promener son chien et parcourir le monde.

Citations