Test de Bile-Esculine pour l’Identification Présomptive des Entérocoques et des Streptocoques: Effets de la Concentration Biliaire, de la Technique d’Inoculation et du Temps d’incubation

La reconnaissance et la différenciation des cocci à gram positif à catalase négative, alpha-hémolytique et non hémolytique en paires et en chaînes en tant qu’entérocoques; les streptocoques du groupe D (principalement le streptocoque bovis); et les streptocoques du groupe viridans non du groupe D sont cliniquement importants (10). Le test bile-esculine est largement utilisé pour différencier les entérocoques et les streptocoques du groupe D, qui tolèrent la bile et peuvent hydrolyser l’esculine en esculétine, des streptocoques du groupe des viridans non du groupe D, qui se développent mal sur la bile. Décrit pour la première fois en 1926 par Meyer et Schonfeld (8), le test de bile-esculine a été montré par Facklam et Moody (2, 3, 5) pour avoir une sensibilité de 100% et une spécificité de 97% pour identifier les entérocoques et les streptocoques du groupe D. Ces résultats ont été obtenus avec des inclusions de gélose contenant 4% d’oxgall (sels biliaires), inoculées avec 1 ou 2 gouttes d’une culture Todd-Hewitt de 24 h de l’organisme (inoculation « le lendemain ») et incubées pendant 48 h. En bactériologie diagnostique de routine, un tel protocole n’est pas pratique, car il nécessite 3 jours à partir du moment où les colonies sont détectées sur les plaques primaires. La plupart des manuels et des manuels de procédure recommandent d’inoculer des inclusions de gélose directement à partir de quelques colonies (inoculation « le même jour ») plutôt que d’une sous-culture de 24 h en bouillon, mais les données à l’appui de cette technique alternative non standardisée manquent.

Par conséquent, nous avons évalué la sensibilité et la spécificité du test de bile-esculine avec deux méthodes différentes d’inoculation le même jour (normalisées et non normalisées) et deux temps d’incubation différents (24 et 48 h). Nous avons également comparé les inclusions d’esculine contenant 2 et 4% d’oxgall dans des formulations actuellement disponibles auprès de deux principales sources commerciales aux États-Unis.

Cocci à gram positif et à catalase négative en paires et en chaînes formant des colonies alpha-hémolytiques ou non hémolytiques sur gélose à 5% de sang de mouton qui étaient positives pour PYR (Murex, Dartford, Royaume-Uni) et ont grandi dans un bouillon de soja tryptique contenant 6,5% de NaCl (Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, Md.) ont été identifiés comme entérocoques; ils ont été spécifiés avec le système Strep rapide API (bioMérieux Vitek, Hazelwood, Mo.). Des cocci à gram positif à catalase négative par paires et des chaînes formant des colonies alpha-hémolytiques ou non hémolytiques qui étaient négatives pour PYR, ne se développaient pas dans 6,5% de NaCl, étaient positives pour l’antigène du groupe D par agglutination au latex (Murex) et présentaient un schéma biochimique suggestif (≥90 % de probabilité) par le système streptococci rapide API ont été identifiés comme S. bovis. Des cocci à gram positif à catalase négative par paires et des chaînes formant des colonies alpha-hémolytiques ou non hémolytiques négatives pour l’antigène PYR et du groupe D (et insolubles dans la bile si alpha-hémolytique) ont été appelés streptocoques du groupe viridans.

Au total, 110 souches d’entérocoques (34 souches d’Enterococcus faecalis, 15 souches d’Enterococcus faecium et 61 souches non hémolytiques et non spécifiées), 30 souches de S. bovis (2 souches alpha-hémolytiques et 28 souches non hémolytiques) et 110 souches streptococciques du groupe viridans non du groupe D (83 souches alpha-hémolytiques et 27 souches non hémolytiques) ont été testées. Les souches ont été isolées consécutivement à partir d’hémocultures réalisées au Centre médical de l’Université Duke pendant une période de 4 ans, à l’exception de 19 S. bovisstrains obtenus à la Clinique Mayo.

Des bactéries fraîches (24 h) ont été inoculées sur trois inclusions de gélose d’esculine différentes contenant soit pas de bile (BDMS), soit 2% d’oxgall (équivalent à 20% de bile) (BDMS), soit 4% d’oxgall (équivalent à 40% de bile) (Remel, Lenexa, Kans.). À l’exception d’oxgall, les compositions des trois médias étaient les mêmes. Pour chaque milieu, les deux techniques d’inoculation suivantes ont été utilisées : (i) inoculation directe en forme de S non standardisée de 1 à 10 colonies et (ii) inoculation indirecte normalisée de 10 µl (boucle calibrée) d’une suspension standard de bactéries de 0,5 McFarland dans de l’eau désionisée stérile. Les inclinaisons ont été incubées à 35 ° C dans l’air ambiant (2) avec des bouchons desserrés pendant 48 h. Les lectures ont été prises à 24 et 48 h. Une réaction a été considérée comme positive lorsque la moitié ou plus du milieu était noircie (4).

À une exception près, les 110 souches d’entérocoques ont donné des réactions positives nettes après 24 et 48 h d’incubation (sensibilité de 99 %). L’inoculum normalisé (environ 106 UFC) était aussi sensible que l’inoculum non normalisé plus lourd. Facklam et Moody, en utilisant un inoculum de 107 à 108 UFC sur des inclusions de gélose, ont rapporté une sensibilité de 100 % à 48 h, mais ont trouvé que 2 souches entérococciques sur 76 (5) et 6 souches entérococciques sur 157 (3) étaient négatives à la bile-esculine (sensibilité de 98 %) après 24 h d’incubation. Swan (13), en utilisant un inoculum non normalisé décrit comme lourd ainsi que des plaques de gélose sur lesquelles tout noircissement était considéré comme un résultat positif, a obtenu une sensibilité de 100% à 24 h avec 121 souches entérococciques. Néanmoins, sur la base des publications de Facklam, la plupart des manuels et manuels de procédures recommandent une incubation pendant 48 h avant de signaler un résultat négatif.

Les 30 souches de S. bovis étaient positives à 24 et 48 h indépendamment de la concentration biliaire ou de la méthode d’inoculation (sensibilité à 100 %). Facklam(3) a rapporté une sensibilité de 94 et 100 % à 24 et 48 h, respectivement, avec 37 souches streptococciques du groupe D.

Le tableau 1 donne les pourcentages de tests de bile-esculine faussement positifs pour 110 souches streptococciques du groupe viridans non du groupe D. Nous avons constaté que la spécificité (100% moins le pourcentage de faux positifs) était maximale (97%) avec un inoculum standardisé strié sur des pentes de gélose contenant 4% d’oxgall et lu après 24 h. Des faux positifs ont été obtenus avec deux Streptococcus milleriet un Streptococcus lactis subsp. diacétylactissoires. Le manque de standardisation de l’inoculum, la diminution de la concentration d’oxgall à 2% et la prolongation du temps d’incubation à 48 h ont augmenté le nombre de faux positifs à un maximum de 24%. Dans des études antérieures avec une gélose d’esculine sélective contenant de l’azoture de sodium et seulement 10% de bile, des réactions positives avec des streptocoques du groupe viridans non du groupe D étaient fréquentes (6, 11, 12). Aucune donnée sur l’utilisation d’un milieu contenant 2% d’oxgall n’a été publiée précédemment. Nos résultats suggèrent que cette concentration est sous-optimale. En utilisant 4 % d’oxgall, Swan (13) a trouvé deux souches streptococciques du groupe viridans tolérantes à la bile sur 21 isolats; aucune des souches n’a cependant hydrolysé l’esculine à 24 h. Facklam et al. spécificités signalées de 99% à 24 h (3) et de 81 (4) à 97% (3) à 48 h avec 4% d’oxgall.

Une différence frappante a été trouvée lorsque les sous-groupes de streptocoques du groupe viridans alpha-hémolytiques et non hémolytiques du groupe D ont été comparés pour le nombre de faux positifs. Pour les souches alpha-hémolytiques, ce nombre était de 0% après 24 h et de 3% après 48 h, alors que pour les souches non hémolytiques, il était de 11% après 24 h et de 33% après 48 h, avec 4% d’oxgall et un inoculum normalisé (P = 0,017 pour les valeurs de 24 h; test exact de Fisher à deux queues). Une telle observation n’a pas été rapportée précédemment.

Pour les échantillons autres que le sang et les sites normalement stériles, un organigramme basé sur le test de bile-esculine combiné à une tolérance de 6,5% au NaCl ou à la présence de PYR est suffisant pour une identification fiable des entérocoques. Les organismes positifs à l’esculine biliaire provenant du sang et des sites normalement stériles doivent être spécifiés. La spéciation des entérocoques est utile pour des raisons épidémiologiques et parce que E. faecium et d’autres espèces ont tendance à être plus résistantes aux antibiotiques que E. faecalis (8, 9). Une identification définitive des ofS. bovis est important, car l’organisme est associé à un carcinome du côlon, qui doit être exclu chez ces patients (7). D’autre part, les rapports faussement positifs ofS. bovis peut conduire à des enquêtes inutiles. La spéciation d’organismes positifs à l’esculine biliaire permettra également la détection de streptocoques faussement positifs du groupe viridans non du groupe D. Des erreurs thérapeutiques peuvent survenir avec une mauvaise identification des streptocoques et des entérocoques (1). La spéciation systématique des organismes bile-esculin négatifs n’est pas nécessaire, car les entérocoques et les streptocoques du groupe D donnent rarement des réactions faussement négatives.

En conclusion, le test bile-esculine fonctionne bien pour séparer rapidement les entérocoques et les streptocoques du groupe D des streptocoques du groupe viridans non du groupe D à faible coût et avec une bonne sensibilité (> 99%) et une bonne spécificité (97%), à condition qu’il soit effectué sur des inclusions de gélose contenant 40% de bile, effectué avec un inoculum normalisé (10 µl d’une suspension bactérienne standard de 0,5 McFarland), et lu à 24 h.