Tyrosinase
8.14.2.2.4 La Tyrosinase (EC 1.14.18.1) et la catéchol oxydase (EC 1.10.3.1)
La tyrosinase, qui appartient à une famille de protéines dont le centre catalytique est formé par le cuivre dinucléaire de type 3, catalyse l’orthohydroxylation de monophénol et l’oxydation ultérieure du produit diphénolique en quinone résultante.178 Une série de réactions se produit lors de la réduction concomitante de l’oxygène moléculaire en eau. Le produit quinone est un précurseur réactif pour la synthèse des pigments de mélanine. La tyrosinase, qui est contenue dans les légumes, les fruits et les champignons, est une enzyme clé du brunissement qui survient lors d’ecchymoses ou d’un stockage à long terme. Chez les mammifères, l’enzyme est responsable d’anomalies de la pigmentation de la peau, telles que des taches et des défauts.179 Ainsi, la tyrosinase est assez importante dans les domaines de l’agriculture et de l’industrie. Dans l’industrie cosmétique, le développement et le dépistage de puissants inhibiteurs de la tyrosinase sont particulièrement attrayants.
La tyrosinase est classée dans la famille des protéines de cuivre de type 3, tout comme la catéchol oxydase et le pigment respiratoire hémocyanine. Au cours de la réaction catalytique, le centre de cuivre de type 3 de la tyrosinase existe sous trois formes redox.178 La forme désoxy (Cu(I) – Cu(I)) est une espèce réduite, qui lie l’oxygène pour donner la forme oxy (Cu(II) – O22–Cu(II)). Sous la forme oxy, l’oxygène moléculaire est lié sous forme de peroxyde dans un mode de pontage latéral μ-η2: η2, ce qui déstabilise la liaison O-O et l’active. La forme met (Cu(II) – Cu(II)) est supposée être une forme enzymatique au repos, où les ions Cu(II) sont normalement pontés à un petit ligand, tel qu’une molécule d’eau ou un ion hydroxyde.
La catéchol oxydase oxyde les orthodiphénols en quinones correspondantes mais manque d’activité monooxygénase ou crésolase. L’hémocyanine agit comme un transporteur d’oxygène chez les arthropodes et les mollusques.
Les structures cristallines de la tyrosinase de Streptomyces castaneoglobisporus HUT 620268 et de la catéchol oxydase de la patate douce Ipomoea batatas180 ont été déterminées. Ils confirment que la coordination du site de cuivre de type 3 dans la tyrosinase et la catéchol oxydase est très similaire à celle trouvée dans l’hémocyanine. Cela avait déjà été déduit de la similitude des propriétés spectroscopiques et d’une comparaison de nombreuses structures primaires de la tyrosinase et de l’hémocyanine.181-183 Sur la base de la source biologique des protéines, sept organisations de domaines différentes ont pu être identifiées. Les catéchol oxydases végétales de différents organismes ont une identité de séquence d’environ 40 à 60%. L’identité de séquence entre les catéchol oxydases et les hémocyanines mullusiennes est d’environ 35% sur presque toute la longueur des séquences. En revanche, l’identité de séquence entre les catéchol oxydases végétales et d’autres protéines de cuivre de type 3 provenant de toute source non végétale est limitée aux deux régions de liaison au cuivre.
Les deux régions de liaison au cuivre présentent la conservation la plus élevée pour toutes les protéines de cuivre de type 3. En particulier, le CuB de liaison à la région est hautement conservé, tandis que la région de liaison à la CuA présente une plus grande variété de séquences et a été tenue responsable des différentes fonctions de la tyrosinase, de la catéchol oxydase et de l’hémocyanine.
La structure globale de la tyrosinase de S. castaneoglobisporus en complexe avec cadre de lecture ouvert ORF378 est affiché sur la figure 23. La tyrosinase prend des structures α-hélicoïdales avec le noyau de l’enzyme, qui est formé par un faisceau de quatre hélices. Le centre de cuivre dinucléaire catalytique est logé dans le faisceau hélicoïdal (Figure 23). Chacun des deux ions cuivre dans un site actif est coordonné par trois résidus His (Figure 24), qui sont dérivés des quatre hélices du faisceau α sauf His54. Un ion cuivre (désigné CuA) est coordonné par His38, His54 et His63. His38 et His63 sont situés au milieu de α2 et α3, respectivement. Le deuxième ion cuivre (CuB) est coordonné par His190, His194 et His216. Les résidus His190 et His194 sont au début et au milieu de α6, respectivement, et His216 est au milieu de α7. Ce centre de dicopper est situé au fond de la grande concavité en tant que poche de liaison au substrat putatif, qui est formée par les résidus hydrophobes. En plus de la structure hélicoïdale, la tyrosinase a quelques structures β, selon les angles de torsion de l’épine dorsale. Dans ceux-ci, seuls les brins β N et C terminaux forment une structure en feuille.
Figure 23. Diagramme en ruban de la tyrosinase de Streptomyces castaneoglobisporus en complexe avec ORF378 (code PDB: 1WX3). La tyrosinase et l’ORF378 sont représentées respectivement en rose et en framboise. Les ions cuivre CuA et CuB sont représentés sous forme de sphères jaunes; préparés avec du PyMOL (W. L. DeLano, Palo Alto, 2003).
Figure 24. La forme met du centre actif de la tyrosinase de Streptomyces castaneoglobisporus (code APB: 1WX3); préparé avec du PyMOL (W. L. DeLano, Palo Alto, 2003).
Bien que la séquence d’acides aminés de la tyrosinase n’ait que 25,3 et 26,0% d’identités avec celles de l’I. batatas catechol oxydase180 et du domaine odg de l’hémocyanine de la Pieuvre dofleini, 184 respectivement, sa structure globale est assez similaire à la leur. Parmi ces trois protéines, un degré élevé de conservation est observé dans le domaine central composé du faisceau α. La tyrosinase et les hémocyanines de Panulirus interruputus185 et L. les polyphèmes 66 ne présentent aucune homologie significative et aucune ressemblance dans leurs structures, mais les domaines catalytiques centraux de ces protéines sont superposables.
Pour la tyrosinase de S. castaneoglobisporus, cinq états différents du site actif ont pu être caractérisés dans les structures cristallines, à savoir la forme sans cuivre, la forme met I, la forme met II, le désoxy et l’oxy. Dans les structures cristallines de la catéchol oxydase de I. batatas, les états met et désoxy ainsi qu’un complexe inhibiteur ont été élucidés. À l’état met (Cu(II), Cu(II)), les deux ions cuivriques sont à une distance de 2.9 Å, chacun d’eux étant coordonné par trois histidines. Ils sont pontés par un autre atome, très probablement un ion hydroxyde, à une distance d’environ 1,8 Å de chaque ion cuprique, de sorte que chacun d’eux a un nombre de coordination de 4 (voir Figure 24, qui montre la même situation pour la tyrosinase de S. castaneoglobisporus). À l’état désoxy ou réduit, les deux atomes de cuivre sont à l’état d’oxydation +1. La distance cuivre-cuivre est de 4,4 Å. Les numéros de coordination sont 4 pour CuA (trois ligands d’histidine et une molécule d’eau coordinatrice) et 3 pour CuB (trois ligands d’histidine). La sphère de coordination est pyramidale trigonale déformée pour CuA et plane carrée pour CuB (le site de coordination occupé par le pontage OH- à l’état met est vacant). Dans le complexe inhibiteur avec la phénylthiourée (PTU), la distance cuivre–cuivre augmente à 4,2 Å avec l’atome de soufre de PTU remplaçant le pont hydroxo de l’état met. Les sphères de coordination des deux cuivres restent similaires à celles de l’état met, mais il y a des changements conformationnels au niveau des résidus du site actif. Le changement le plus significatif est une rotation du cycle aromatique de Phe261 (numérotation de la catéchol oxydase).
Par rapport à l’état met, les résidus de coordination n’ont que des positions légèrement différentes à l’état réduit, indiquant une poche plutôt rigide. Les changements de coordination sont associés aux mouvements des atomes de cuivre dans la poche. Le complexe inhibiteur montre que Phe261 est situé au-dessus du site actif comme une porte, qui tourne après la fixation de l’inhibiteur. Ainsi, l’accès du substrat au centre métallique catalytique semble être contrôlé par ce « résidu de grille « .
Le mécanisme catalytique de la tyrosinase a d’abord été étudié en détail par Solomon et al.178 Solomon a proposé un mécanisme pour les activités crésolase et catécholase de la tyrosinase (figure 25). Ce mécanisme suggère que l’état oxy est le point de départ de l’activité de la crésolase (cercle intérieur). Cet état est présent sous forme de tyrosinase au repos dans une proportion d’environ 15% (état met à 85%). Un substrat monophénol se lie à l’état oxy et est monooxygéné en o-diphénol. Ce diphénol se lie ensuite au centre cuivré de la tyrosinase met selon un mode de liaison bidentate proposé à partir d’un composé modèle.188 L’oxydation du substrat de diphénol conduit à l’état réduit du centre dinucléaire du cuivre. La réoxydation de l’état réduit à l’état oxy se produit par attaque de dioxygène et ferme le cycle catalytique.
Figure 25. Mécanisme de l’activité crésolase et catécholase de la tyrosinase et de la catéchol oxydase développé sur la base d’une proposition initiale de Solomon et coworkers178 et incluant des résultats plus récents.186,187 Reproduit d’après C. Gerdemann; C. Eicken; B. Krebs, Acc. Chem. Res. 2002, 35, 183-191, avec l’autorisation de l’American Chemical Society.
Le mécanisme de l’activité de la catécholase (cercle extérieur) part des états oxy et met. Un substrat de diphénol se lie à l’état met (par exemple), suivi de l’oxydation du substrat en première quinone et de la formation de l’état réduit de l’enzyme. La liaison du dioxygène conduit à l’état oxy, qui est ensuite attaqué par la deuxième molécule de diphénol. L’oxydation en deuxième quinone forme à nouveau l’état met et ferme le cycle catalytique.
Les mécanismes réactionnels alternatifs comprennent un mécanisme radicalaire proposé par Kitajima et Morooka189 et un mécanisme impliquant un intermédiaire Cu(III) basé sur des mesures de composés modèles.190 Sur la base de la structure cristalline du complexe inhibiteur de la catéchol oxydase–PTU, la liaison monodentate du substrat a été suggérée pour la catéchol oxydase.180 Un mécanisme radicalaire, tel que proposé pour la faible activité de la catécholase trouvée dans l’hémocyanine de Octopus vulgaris, 191 est également possible pour la catéchol oxydase en raison de la forte relation structurelle entre la catéchol oxydase de I. batatas et l’hémocyanine odg comme décrit ci-dessus.
La différence nette entre la catéchol oxydase et la tyrosinase n’a pas encore été expliquée. Une phase de retard dans l’activité monophénolase de la tyrosinase a été trouvée et étudiée et est proposée comme le résultat d’une inhibition temporaire de l’état met de la tyrosinase par un excès du substrat monophénol (Figure 25).186 L’activité de la monophénolase augmente lorsque le produit diphénol déplace le monophénol de la met tyrosinase et permet la poursuite du cycle catalytique. La catéchol oxydase sous sa forme isolée est présente exclusivement à l’état met et est également inhibée par le phénol. Il a donc été suggéré que l’absence de l’état oxy est la raison pour laquelle la catéchol oxydase manque d’activité crésolase. Comme l’oxy catéchol oxydase ne montre pas non plus d’activité monooxygénase, cette explication ne semble pas entièrement satisfaisante. Une autre raison possible est que l’accès au CuA, qui a été proposé pour être nécessaire à l’oxygénation des monophénols, 192 est bloqué dans la structure cristalline de la catéchol oxydase de I. batatas.