galde-Esculin-Test til formodet identifikation af enterokokker og streptokokker: virkninger af Galdekoncentration, Inokulationsteknik og inkubationstid

anerkendelse og differentiering af katalase-negative, alfa-hæmolytiske og ikke-hæmolytiske gram-positive kokker i par og kæder som enterokokker; Gruppe D streptokokker (hovedsageligstreptococcus bovis); og ikke-Gruppe D viridans gruppe streptokokker er klinisk vigtige (10). Galle-esculin-testen bruges i vid udstrækning til at differentiere enterokokker og gruppe D streptokokker, som er galdetolerante og kan hydrolysere esculin til esculetin, fra ikke-Gruppe D viridans-gruppe streptokokker, der vokser dårligt på galden. Først beskrevet i 1926 af Meyer og Schonfeld (8) blev Galle-esculin-testen vist af Facklam og Moody (2, 3, 5) at have en følsomhed på 100% og en specificitet på 97% til identifikation af enterokokker og gruppe D streptokokker. Disse resultater blev opnået med agarskråninger indeholdende 4% oksgall (galdesalte), inokuleret med 1 eller 2 dråber af en 24-h Todd-Hevitt både kultur af organismen (“næste dag” inokulation) og inkuberet i 48 h. i rutinemæssig diagnostisk bakteriologi er en sådan protokol upraktisk, da den kræver 3 dage fra det tidspunkt, hvor kolonier detekteres på primære plader. De fleste lærebøger og proceduremanualer anbefaler inokulering af agarskråninger direkte fra et par kolonier (“samme dag” inokulation) snarere end fra en 24-h subkultur i bouillon, men data, der understøtter denne ikke-standardiserede alternative teknik, mangler.

derfor vurderede vi følsomheden og specificiteten af Galle-esculin-testen med to forskellige metoder til inokulation samme dag (standardiseret og ikke-standardiseret) og to forskellige inkubationstider (24 og 48 timer). Vi sammenlignede også esculin slants indeholdende 2 og 4% oksgall i formuleringer, der i øjeblikket er tilgængelige fra to store kommercielle kilder i USA.

katalase-negative, gram-positive kokker i par og kæder, der danner alfa-hæmolytiske eller ikke-hæmolytiske kolonier på 5% fåreblodagar, der var positive for PYR (Mureks , Dartford, Storbritannien) og voksede i tryptisk sojabuljong indeholdende 6,5% NaCl (Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, MD. de blev identificeret som enterokokker; de blev specieret med API Rapid Strep-systemet (biomarrieuks Vitek, Hasseltræ, Mo.). Katalase-negative, gram-positive kokker i par og kæder, der dannede alfa-hæmolytiske eller ikke-hæmolytiske kolonier, der var negative for PYR, voksede ikke i 6,5% NaCl, var positive for gruppe D-antigen ved lateks agglutination (Mureks) og havde en suggestiv (sandsynlighed for 90%) biokemisk mønster af API Rapid Strep-systemet blev identificeret som S. bovis. Katalase-negative, gram-positive kokker i par og kæder, der dannede alfa-hæmolytiske eller ikke-hæmolytiske kolonier, der var negative for PYR-og gruppe D-antigen (og var uopløselige i galden, hvis alfa-hæmolytisk) blev kaldt viridans-gruppe streptokokker.

i alt 110 enterokokstammer (34 Enterococcus faecalis, 15 Enterococcus faecium og 61 ikke-hæmolytiske og ikke-specierede Stammer), 30 S. bovis-stammer (2 alfa-hæmolytiske og 28 ikke-hæmolytiske stammer) og 110 ikke-Gruppe D viridans-gruppe streptokokstammer (83 alfa-hæmolytiske og 27 ikke-hæmolytiske stammer) blev testet. Stammerne blev isoleret fortløbende fra blodkulturer udført på Duke University Medical Center i en 4-årig periode, bortset fra 19 S. bovisstrains, der blev opnået fra Mayo Clinic.

friske (24-h) bakterier blev inokuleret på tre forskellige esculin-agarskråninger indeholdende enten ingen galde (BDMS), 2% oksgall (svarende til 20% galde) (BDMS) eller 4% oksgall (svarende til 40% galde) (Remel, Leneksa, Kans.). Bortset fra oksgall var sammensætningerne af de tre medier de samme. For hvert medium blev følgende to inokulationsteknikker anvendt: (i) direkte, ikke-standardiseret S-formet inokulation af 1 til 10 kolonier og (ii) indirekte, standardiseret inokulation af 10 liter (kalibreret sløjfe) af en 0,5 McFarland standard suspension af bakterier i sterilt deioniseret vand. Skråningerne blev inkuberet ved 35 liter C i omgivende luft (2) med løse hætter i 48 timer. aflæsninger blev taget ved 24 og 48 timer. en reaktion blev betragtet som positiv, når halvdelen eller mere af mediet blev sorte (4).

med en undtagelse gav alle 110 enterokokstammer klare positive reaktioner efter 24 og 48 timers inkubation (99% følsomhed). 106 CFU) var lige så følsom som det tungere, ikke-standardiserede inokulum. Facklam og Moody rapporterede ved anvendelse af et inokulum på 107 til 108 CFU på agarskråninger en følsomhed på 100% ved 48 timer, men fandt, at 2 af 76 (5) og 6 af 157 (3) enterokokstammer var galde-esculin-negative (98% følsomhed) efter 24 timers inkubation. Svanen (13) opnåede ved anvendelse af et ikke-standardiseret inokulum beskrevet som tungt såvel som agarplader, på hvilke enhver formørkning blev anset for at være et positivt resultat, en følsomhed på 100% ved 24 timer med 121 enterokokstammer. Ikke desto mindre, baseret på Facklams publikationer, anbefaler de fleste lærebøger og proceduremanualer inkubation i 48 timer, før de rapporterer om et negativt resultat.

alle 30 stammer af S. bovis var positive ved 24 og 48 timer uanset galdekoncentrationen eller inokulationsmetoden (100% følsomhed). Facklam (3) rapporterede en følsomhed på 94 og 100% ved henholdsvis 24 og 48 timer med 37 Gruppe D streptokokstammer.

tabel 1 viser procentdelene af falsk-positive galde-esculin-test for 110 ikke-Gruppe D viridans-gruppe streptokokstammer. Vi fandt ud af, at specificiteten (100% minus procent falsk positiv) var maksimal (97%) med et standardiseret inokulum stribet på agarskråninger indeholdende 4% oksgall og læst efter 24 timer. falske positiver blev opnået med to Streptococcus milleriog en Streptococcus lactis subsp. diacetylaktisstræer. Manglende standardisering af inokulumet, fald i koncentrationen af oksgall til 2% og forlængelse af inkubationstiden til 48 timer øgede antallet af falske positiver til maksimalt 24%. I tidligere undersøgelser med en selektiv esculin-agar indeholdende natriumatsid og kun 10% galde var positive reaktioner med ikke-Gruppe D viridans-gruppe streptokokker almindelige (6, 11, 12). Der er ikke tidligere offentliggjort data om brugen af et medium, der indeholder 2% oksgall. Vores resultater tyder på, at denne koncentration er suboptimal. Ved hjælp af 4% oksgall fandt Svanen (13) to galdetolerante viridans-gruppe streptokokstammer ud af 21 isolater; hverken stamme hydrolyseret esculin ved 24 h. Facklam et al. rapporterede specificiteter på 99% ved 24 timer (3) og 81 (4) til 97% (3) ved 48 timer med 4% oksegall.

en slående forskel blev fundet, når undergrupperne af alfa-hæmolytiske og ikke-hæmolytiske ikke-Gruppe D viridans gruppe streptokokker blev sammenlignet for antallet af falske positiver. For Alfa-hæmolytiske stammer var dette tal 0% efter 24 timer og 3% efter 48 timer, mens det for ikke-hæmolytiske stammer var 11% efter 24 timer og 33% efter 48 timer med 4% oksgall og et standardiseret inokulum (P = 0,017 for 24-h-værdier; to-tailed Fishers nøjagtige test). En sådan observation er ikke blevet rapporteret tidligere.

for andre prøver end blod og normalt sterile steder er et rutediagram baseret på galde-esculin-testen kombineret med 6, 5% NaCl-tolerance eller tilstedeværelse af PYR tilstrækkelig til pålidelig identifikation af enterokokker. Galde-esculin-positive organismer fra blod og normalt sterile steder bør specificeres. Speciering af enterokokker er nyttig af epidemiologiske årsager, og fordi E. faecium og andre arter har tendens til at være mere resistente over for antibiotika end E. faecalis (8, 9). En endelig identifikation afs. bovis er vigtig, da organismen er forbundet med koloncarcinom, hvilket bør udelukkes hos sådanne patienter (7). På den anden side falske positive rapporter ofS. bovis kan føre til unødvendige undersøgelser. Speciering af galde-esculin-positive organismer vil også tillade påvisning af falsk-positive ikke-Gruppe D viridans gruppe streptokokker. Terapeutiske fejl kan forekomme ved forkert identifikation af streptokokker og enterokokker (1). Rutinemæssig speciering af galde-esculin-negative organismer er ikke nødvendig, da enterokokker og gruppe D streptokokker sjældent giver falsk-negative reaktioner.

afslutningsvis fungerer Galle-esculin-testen godt til hurtigt at adskille enterokokker og gruppe D streptokokker fra ikke-Gruppe D viridans-gruppe streptokokker til lave omkostninger og med god følsomhed (>99%) og specificitet (97%), forudsat at den udføres på agarskråninger indeholdende 40% galden, udført med et standardiseret inokulum (10 liter af en 0,5 McFarland standard bakteriesuspension) og læses ved 24 timer.