Genetiske kryds

et genetisk kryds er den målbevidste parring af to individer, hvilket resulterer i kombinationen af genetisk materiale i afkom. Kryds kan udføres i mange modelsystemer—inklusive planter, gær, fluer og mus—og kan bruges til at dissekere genetiske processer eller skabe organismer med nye træk.

denne video vil dække nogle af principperne for genetiske kryds, undersøge en metode til udførelse af kryds kendt som tetrad analyse og diskutere flere anvendelser af denne teknik.

lad os først introducere de grundlæggende principper for arv, der muliggør genetiske kryds.

en organismes fænotype eller sammensætning af træk påvirkes af dens genetiske sammensætning eller genotype. I de fleste seksuelt reproducerende organismer producerer forældregenerationen haploide gameteceller, som har en kopi af hvert særskilt kromosom. Disse smelter derefter under parring for at producere et diploid afkom med to homologe kopier af hvert kromosom. Hvis begge kromosomer indeholder den samme allel, eller variantform af et gen, så er organismen “homosygøs” på det genetiske sted; ellers, det er “heterosygøst.”

for at starte cyklussen på ny genererer den diploide organisme igen haploide kønsceller via meiose. Under denne proces gennemgår de to homologe kromosomer “rekombination”, hvor bits af ækvivalente sekvenser udveksles mellem parret. Denne proces blander forældrenes alleler, der er arvet af hvert afkom, og derved øger deres genetiske mangfoldighed.

en af de første mennesker, der udførte systematiske genetiske kryds, var “genetisk far”, Gregor Mendel. Ved at bruge den let manipulerede ærteplante og undersøge en række træk med ensartede arvemønstre var Mendel i stand til at udlede tre grundlæggende arvelove, der ville danne grundlaget for genetik.

Mendels første lov er Loven om ensartethed, der siger, at heterosygotafkom fra den første eller F1 generation af to homosygøse individer vil have fænotypen af kun en forælder. Allelen, der etablerer denne fænotype, kaldes “dominerende”, mens den “skjulte” allel er “recessiv.”Vi ved nu, at dominansforhold ofte er mindre klare, med tilfælde som ufuldstændig dominans, hvor heterosygoter udtrykker en blandet fænotype; og codominance, hvor begge fænotyper vises.

Segregeringsloven siger, at en allel er tilfældigt tildelt hver gamete. Ved at observere, at F2 afkom fra selvbefrugtning af heterosygote F1 individer viste en 3:1 fænotypisk forhold, men at to af de fænotypisk dominerende individer faktisk er heterosygoter, udledte Mendel, at de to forældrealleler skal arves separat. I dag ved vi, at segregering forekommer under meiose, når de to homologe kromosomer af den diploide forælder er opdelt tilfældigt i haploide datterceller, der hver arver en af de to alleler.

Mendels tredje lov er Loven om uafhængigt sortiment, der siger, at individuelle træk arves uafhængigt. Vi ved nu, at absolut uafhængighed kun eksisterer for træk kontrolleret af gener på separate kromosomer i haploidsættet, som distribueres uafhængigt af datterceller under meiose. For to gener på det samme kromosom er afstanden mellem dem omvendt proportional med sandsynligheden for, at de rekombineres på forskellige homologe kromosomer, og i forlængelse heraf, hvor sandsynligt de arves sammen i det samme afkom. Derfor giver analysen af de fire meiotiske produkter fra en diploid organisme en måde for forskere at kortlægge placeringen af gener.

efter at have gennemgået principperne bag genetiske kryds, lad os se på en protokol til tetradanalyse.

denne teknik anvendes typisk på visse enkeltcellealger eller svampe, såsom gær, for at dissekere de fire haploide meiotiske produkter eller sporer, som i disse arter forbliver sammen som en “tetrad” i en enkelt cellelegeme.

for at udføre tetradanalyse i gær dyrkes de ønskede stammer først på passende medier. Gærceller fra individuelle kolonier får lov til at parre sig, for eksempel ved at stribe hver Stamme i et krydsmønster på en ny plade. Denne plade replikeres derefter på selektive medier for kun at isolere korsets diploide produkt.

udvalgte diploide celler dyrkes på næringsfattige medier for at inducere sporulation og tetraddannelse. Asci, som er de strukturer, der holder tetraderne af sporer, fordøjes i opløsninger indeholdende fermolyasen. Efter fordøjelsen manipuleres individuelle asci ved hjælp af et tetrad-dissekerende mikroskop. De er arrangeret på bestemte steder på en vækstplade og forstyrret for at frigøre de enkelte sporer. Disse kan placeres i et gitterlignende mønster, hvor hver spore ville generere en individuel koloni, der kan analyseres yderligere.

nu hvor du ved, hvordan tetrad-analyse udføres, lad os undersøge nogle af de mange applikationer eller ændringer af denne teknik.

Manuel dissektion af tetrader er tidskrævende, og forskere har udtænkt alternativer med høj kapacitet, såsom stregkodeaktiveret sekventering af tetrader. I denne metode blev det diploide afkom fra et gærkors transformeret med et bibliotek af plasmider, som hver indeholder en kort, unik sekvens kendt som en “stregkode”, der fungerer som en identifikator for hvert afkom. Plasmiderne udtrykker også GFP, så gær asci kan vælges via strømningscytometri og sorteres på agarplader. Asci blev lyseret en masse på pladerne, og sporerne fik lov til at vokse til små kolonier. Kolonierne blev derefter tilfældigt fordelt til 96-brøndsplader til genotypebestemmelse. Den unikke sekvensstregkode giver forskere mulighed for at gruppere de fire kolonier, der opstod fra sporer fra hver tetrad.

genetiske kryds kan også bruges til at generere gærceller med et stort antal genudslip. I den grønne monsterproces parres og sporuleres haploid mutantgær, der bærer forskellige gensletninger markeret med GFP. Disse haploide afkom, hvoraf nogle bærer sletninger arvet fra begge forældre, sorteres via fluorescensaktiveret strømningscytometri, hvor GFP-intensitet blev vist at korrelere med antallet af sletninger, der er til stede i en bestemt gærstamme. Disse udvalgte celler blev derefter dyrket og krydset igen. Gentagelse af denne cyklus genererede gærstammer indeholdende adskillige sletninger.

endelig er genetiske kryds blevet tilpasset til brug i mange modelsystemer, såsom den malaria-forårsagende intracellulære parasit Plasmodium. Da parasitten kun kan reproducere inden for andre celler, skal alle krydsende trin udføres hos henholdsvis mus eller myg, parasitens naturlige vært og vektor. Her blev mus inficeret med to unikke Plasmodium-stammer på blodparasitstadiet. Parasitterne blev derefter overført til myg via blodfodring, og når de først var inde, modnede de til kønsceller, der ville befrugte for at danne diploide gygoter. De modne sporosoitter blev derefter høstet fra myggen og brugt til at inficere na-kurvemus, hvor parasitterne blev formeret til isolering af krydsafkom af interesse.

du har lige set JoVE ‘ s video om genetiske kryds. I denne video introducerede vi principperne om arv, hvordan genetiske kryds i nogle organismer kan analyseres med tetrad-dissektion og et par aktuelle applikationer. Som altid, tak for at se!