a hepatitis E vírus semlegesítő Epitópjainak különböző jellemzőit Azonosító Kompetitív kötési vizsgálat létrehozása

absztrakt

célja: a hepatitis E vírus (HEV) genotípus-specifikus és közös semlegesítő epitópjainak különböző jellemzőinek megerősítése. Módszerek: Kompetitív kötési vizsgálatot hoztak létre ismert genotípus-közös semlegesítő monoklonális antitestek (MABS) 3G1 és 5G5, valamint genotípus-specifikus semlegesítő MABS 2B1 és 4C5. Bevont antigénként HEV ORF2 rekombináns p166W01 1-es genotípusból és p166chn 4-es genotípusból származtak annak meghatározására, hogy a MAB-ok felismerik-e a független, hasonló vagy átfedő epitópokat. a MAB-kat torma-peroxidázzal (HRP) konjugálták, tisztították. A HRP-konjugált 2B1 csak a p166W01-gyel tudott reagálni, de a p166Chn-nel nem, a HRP-konjugált 4C5 csak a p166Chn-nel tudott reagálni, de a p166W01-gyel nem, míg a HRP-konjugált 3G1 és 5G5 a p166W01-gyel és a p166Chn-nel egyaránt. Így kompetitív kötési vizsgálatokat végeztünk egymás után p166W01 és p166Chn antigén alkalmazásával. Eredmények és következtetés: a Kompetitív kötési vizsgálatok eredményei azt mutatták, hogy a HRP-konjugált 2B1 p166w01-hez való kötődését az 5G5 vagy a 3G1 nem gátolhatja. Hasonlóképpen, a HRP-konjugált 4C5 p166chn-hez való kötődését 5G5 vagy 3G1 nem tudta gátolni. A mAbs 5G5 és 3G1 azonban blokkolta egymás kötődését a p166W01-hez és a p166Chn-hez, ami arra utal, hogy a közös és genotípus-specifikus semlegesítő MAB-ok felismerik a független epitópokat.

6018 S. Karger AG, Basel

Bevezetés

a Hepatitis E vírus (HEV) egy nem fertőzött, pozitív szálú RNS vírus, amely elsősorban szájon át terjed, és akut humán hepatitis E-t okoz . A HEV-fertőzés káros prognosztikához vezethet, például életelégtelenséghez, súlyos akut hepatitishez, krónikus fertőzéshez az átültetett szervben és immunszuppresszált betegeknél, valamint magas mortalitáshoz terhes nőknél . Az emberek megerősített fertőzése mellett a HEV-k az állatokat is megfertőzik, és állatokról emberre is átvihetők; a hepatitis E fertőzés előfordulása a fejlett országokban is jelentősen megnőtt . Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a HEV közegészségügyi veszélyt jelent az egész világon .

bár egy szerotípust felismertek, a világ különböző területeiről származó HEV izolátumokat 4 fő genotípusba lehet besorolni . Az 1-es és 2-es genotípusú hev-k epidemiológiai, antigén és immunogén tulajdonságaikban különböznek a 3-as és 4-es genotípustól .

a mai napig az antigén epitóp jellemzésének kutatása elsősorban a HEV szerkezeti fehérje egy in vitro tenyésztési rendszer számára nem áll rendelkezésre . a pORF2 az ORF2 által kódolt fő HEV szerkezeti fehérje, amely 1 a vírusgenom 3 átfedő nyitott olvasókeretéből (ORF). A porf2 domináns immunogén régióit a C-terminális 2/3 régióban lokalizálták, amelyek a vakcina fejlesztésének fő célpontjai voltak .

korábbi Vizsgálatunk kimutatta, hogy immunogenitási különbség van a 4-es genotípusból származó p179 hepatitis E vakcina (439-617 aminosav az ORF2 fehérje) és az 1-es genotípusból származó p239 (Hecolin) között, a különbség a HEV genotípus-specifikus epitóp(ok) jelenlétének tulajdonítható . A GE notype-specifikus epitóp (ok) jelenlétének igazolására monoklonális antitesteket (MAB-kat) alkalmaztak, amelyeket p166sar-ral(452-617 aminosav az ORF2 fehérje) immunizáltak az 1-es genotípusból, illetve p166Chn-t a 4-es genotípusból. A 2 genotípus-közös semlegesítő MAB, 3G1 és 5G5 mellett 2 genotípus-specifikus semlegesítő MAB, 2B1 és 4C5 is kapott. A 2B1 a p166Sar ellen specifikusan kötődött az 1-es és 2-es genotípusú rekombináns fehérjékhez, és in vitro csak az 1-es és 2-es genotípusú törzseket semlegesítette; A 4C5 a p166Chn-nel szemben immunreaktált specifikusan a 3-as és 4-es rekombináns fehérjékkel szemben, és csak a 3-as és 4-es genotípusú törzseket semlegesítette, míg a 3G1 a p166Sar-ral és az 5G5 a p166Chn-ral szemben az 1-4-es rekombináns fehérjékhez és a 4-es genotípusú törzsekhez kötődött . A HEV genotípus-közös és genotípus-specifikus semlegesítő epitópjainak különböző jellemzőinek további vizsgálatához kompetitív kötési vizsgálatot fejlesztettek ki a mAbs 2B1, 3G1, 4C5 és 5G5 alkalmazásával annak megerősítésére, hogy a MABS által felismert epitópok függetlenek, hasonlóak vagy átfedésben vannak-e.

anyagok és módszerek

rekombináns fehérjék

a rekombináns p166 a pORF2 csonka fehérje volt, a nukleotidszekvenciák a következő HEV törzsekből származtak: W01 (1-es genotípus, JX857689) és China-9829 (4-es genotípus, AY789225). A rekombináns plazmidokat Escherichia coli-ban állítottuk elő és expresszáltuk . A 2 His-tagged p166 fehérjét p166W01-nek, illetve p166Chn-nek nevezték el.

MAB termelés

a korábban leírt összesen 4 semlegesítő MAB-ot, 2B1-et, 3G1-et, 4C5-öt és 5G5-öt alkalmaztunk egy kompetitív enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálat (Elisa) kifejlesztésére. A 2B1-et és a 3G1-et a p166Sar ellen emelték; a 4C5-öt és az 5G5-öt a p166Chn ellen emelték . A MAB-okat úgy állítottuk elő, hogy 106 hybridoma sejtet injektáltunk egy BALB/c egér peritoneális üregébe; a MAB-okat tartalmazó ascites folyadékot 7-10 nap elteltével betakarítottuk, szűrtük, centrifugáltuk, és -80 kb-on tároltuk .

MABS tisztítása

a MAB ascites folyadékot protein G-szefaróz oszlop affinitás kromatográfiával tisztítottuk (Sigma, Németország). Az antitestet tartalmazó frakciókat az immobilizált g proteinből savas elúciós pufferrel (0,1 M glicin-HCl, pH 2,8) gyűjtöttük össze, majd 280 nm-en határoztuk meg; a 280 nm-es abszorbancia (A280) felhasználható a MAB-ok nagyjából számszerűsítésére. Nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélelektroforézist alkalmaztak a tisztított frakciók megerősítésére és mennyiségi meghatározására szarvasmarha szérum albumin felhasználásával .

a torma-peroxidáz MABS-hez való kapcsolását

a tisztított MAB-kat 100 mM-es karbonát/bikarbonát pufferrel (pH 9,3) dializáltuk egy éjszakán át 4 db C-on . Az antitesteket a gyártó utasításai (kpl) szerint Torma-peroxidázhoz (HRP) kapcsoltuk. Körülbelül 1,5 mg HRP-t 0,5 mg mAb-val 0,5 mL teljes térfogatú HRP konjugációs pufferben kevertünk el, szobahőmérsékleten 1 órán át kíméletesen kevergetve. az elegyet 15 percig szobahőmérsékleten hagytuk, miután 10 ml redukálószert adtunk hozzá, majd 1 térfogat desztillált glicerint adtunk hozzá tárolás és további felhasználás céljából.

HRP-konjugált MAB-ok Keresztreaktivitása heterológ P166 antigénnel

az ELISA-módszert alkalmaztuk a HRP-konjugált MAB-ok p166w01 és p166Chn antigénnel való keresztreaktivitásának megerősítésére . Röviden, a mikrolemezek kútjait 100 ng p166W01, illetve p166Chn antigénnel vontuk be, 2 órán át inkubáltuk 37 Kb c-n. ezt követte a bevont antigének eltávolítása; 200 ml foszfát-pufferelt sóoldatot (PBS), amely 0,1% szarvasmarha szérum albumint tartalmaz, kutakba adtuk, majd a mikrolemezeket szobahőmérsékleten, enyhe rázással inkubáltuk. Két órával később a blokkoló puffert eldobtuk, és a kutakat kétszer mossuk 0,05% Tween-20-at (PBST) tartalmazó PBS-sel. A HRP-konjugált MAB-k soros 2-szeres hígításait 1: 400-tól 1: 25 600-ig 1% kazein PBS-ben adtuk hozzá a megfelelő kutakba, majd 45 perc inkubációt végeztünk 37-nél 67 C-nél; a kazein PBS-t 5-ször PBST-vel történő mosással távolítottuk el. Tetrametil-benzidin folyékony szubsztrátot adtunk a színfejlesztéshez inkubáláshoz 37cc alatt 10 percig. Végül az egyes kutak optikai sűrűségét (OD) 450 nm-en olvastuk, 630 nm-es referencia hullámhosszal.

antigén-és MAB-titerek meghatározása

az antigén-és MAB-titereket ELISA-val határoztuk meg. Kezdetben a HRP-konjugált MAB-k soros 2-szeres hígításait 1: 400-tól 1: 25 600-ig 1% kazein PBS-ben állítottuk elő, majd a p166w01 vagy p166Chn antigén soros hígításaival előbevonott kutakhoz adtuk. Ezt 45 perces inkubáció követte 37cc-nél, a nem kötött MAB-kat 5-ször pbst-vel történő mosással távolítottuk el. Tetrametil-benzidin folyékony szubsztrátot adtunk a színfejlődéshez egy 10 perces inkubációhoz 37cc-N. Végül az egyes kutak OD-ját 450 nm-en, 630 nm-es referencia-hullámhosszon olvastuk, hogy meghatározzuk a telítetlen hígítást, és körülbelül 1,0 OD-értéket adtunk 450 nm-en, 630 nm-es referencia-hullámhosszon.

Kompetitív kötési vizsgálat

a HEV közös és genotípus-specifikus semlegesítő epitópjainak különböző jellemzőit egy közös és genotípus-specifikus semlegesítő MAB-kkal létrehozott páros kompetitív kötési vizsgálat segítségével vizsgáltuk . A módszerek hasonlóak voltak a fent leírt eljárásokhoz, azzal a különbséggel, hogy bevonó antigénként p166w01-et és p166Chn-t használtunk, és a bevont kutakhoz kétszer akkora koncentrációban HRP-konjugált mAb keverékeket, illetve telített koncentrációban nem konjugált MAB-ot adtunk. Az OD-t 450 nm-en mértük, 630 nm-es referencia hullámhosszal. A százalékos gátlást a következő képlettel számítottuk ki: 100 Ft. A versenyt pozitívnak értékelték, ha a gátlási százalék több mint 50% volt.

eredmények

HRP-konjugált MAB-ok Keresztreaktivitása heterológ P166 antigénnel

az ELISA módszert alkalmazták a HRP-konjugált MAB-ok p166w01 és p166Chn antigénekkel való keresztreaktivitásának értékelésére. Az eredmények azt mutatták, hogy a HRP-konjugált 2B1 1: 400-tól 1: 25 600-ig terjedő hígításoknál csak a p166W01-rel reagált, a p166Chn-nel nem, a HRP-konjugált 4C5 pedig az 1: 400-tól 1: 25 600-ig terjedő hígításoknál csak a p166Chn-rel reagált. Ezzel szemben a HRP-konjugált 3G1 és 5G5 1: 400 és 1: 25 600 közötti hígításban jól reagált a 2 p166 fehérjével (ábra. 1). Ezek a megfigyelések hasonlóak voltak a korábbi megállapításokhoz, a 2B1 és a 4C5 genotípus-specifikus MAB-ok, míg a 3G1 és az 5G5 genotípus-közös MAB-ok .

a P166w01 antigén és a HRP-konjugált MAB titerek meghatározása a

P166w01 antigén Kompetitív kötési vizsgálatához a MABS 2B1, 3G1 és 5G5 kompetitív kötési vizsgálatához; a MABS és az antigén megfelelő titereit ELISA-val határoztuk meg. Amint az 1. táblázatban látható, négyzetes titrálás után, amikor a p166W01 antigén hígítása 1: 400 volt, a HRP-konjugált 2B1 1: 6400 volt, az átlagos OD-érték közel 1,0 volt. Eközben, amint azt a 2. táblázat mutatja, amikor az antigén hígítása 1: 400 volt, a HRP-konjugált 5G5 és a HRP-konjugált 3G1 1: 6,400 és 1: 12,800 volt, és az átlagos OD-érték közel 1,0 volt.

a P166chn antigén és a HRP-konjugált MAB titerek meghatározása a

Kompetitív kötési vizsgálathoz a p166Chn antigént használtuk a MABS 4C5, 3G1 és 5G5 kompetitív kötési tesztjének megállapításához, a MABS és az antigén megfelelő titereit is ELISA-val határoztuk meg. Amint azt a 3. táblázat mutatja, négyzetes titrálás után, amikor a p166Chn antigén hígítása 1: 800 volt, a HRP-konjugált 4C5 1: 6400 volt, és az átlagos OD-érték közel 1,0 volt. Eközben, amint azt a 4. táblázat mutatja, amikor az antigén hígítása 1: 800 volt, a HRP-konjugált 5G5 és a HRP-konjugált 3G1 hígításai sorrendben 1: 6400 és 1: 12 800 voltak; az átlagos OD-érték közel 1,0 volt.

a MAB-K P166w01-hez való kötődésének gátlása

a gátlás eredményeit az 5. táblázat mutatja; a HRP-konjugált 2B1 kötődését a p166W01 antigénhez a nem konjugált 2B1 gátolta 68% – os gátlással. Nem volt szignifikáns gátlás a 2B1 között a mAbs 5G5 és 3G1 esetében (27 és 30%). A 3G1 és 5G5 heterológ MAB-kból teljesebb gátlást kaptunk, mivel a HRP-3G1 antigénhez való kötődését az 5G5 gátolta 61%-os gátlással, a HRP-konjugált 5G5 antigénhez való kötődését a 3G1 gátolta 99% – os gátlással. A HRP-3G1 és HRP-5G5 p166W01 antigénhez való kötődését szintén szinte teljesen gátolták (81 és 80% – os gátlás). Ezek az eredmények azt sugallják, hogy a 3G1 és az 5G5 ugyanazt az epitópot vagy átfedő epitópot oszthatja meg, de a 2B1 valószínűleg felismer egy másik epitópot.

a MABS P166chn-hez való kötődésének gátlása

a gátlás eredményeit az 5.táblázat mutatja: a HRP-4C5 kötődését a P166CHN-hez a nem konjugált 4C5 gátolta 69% – os gátlással, nem volt szignifikáns gátlás (25 és 30%) a másik 2 nem konjugált mAbs 3G1 és 4C5 esetében. A HRP-konjugált MABS 3G1 és 5G5 antigénhez való kötődésével azonban magasabb gátlási arányt sikerült elérni, amelyet a nem konjugált 5G5 és 3G1 gátolt 65 és 76% – os gátlással. A HRP-konjugált 3G1 és HRP-konjugált 5G5 p166Chn antigénhez való kötődését szintén szinte gátolták. Ezek az eredmények azt is sugallják, hogy a 3G1 és az 5G5 ugyanazt az epitópot vagy átfedő epitópot oszthatja meg, míg a 4C5 valószínűleg felismer egy másik epitópot.

megbeszélés

mivel az új sertéshev-t először izolálták , számos állatnál jelentettek HEV-ellenes antitesteket, amelyek HEV-fertőzést mutattak ki állatok és emberek között, és ez állatokról emberre terjedhet . A hepatitis E morbiditásának és mortalitásának csökkenése a vakcina prevenciójától és a hatékony diagnózistól függött. A HEV epitópjainak ismerete elengedhetetlen volt a vakcina előkészítéséhez és a diagnosztikai fejlesztéshez . A szérumban a specifikus antitestek kimutatása az egyik fő diagnosztikai módszer, és egyre több az antitest kimutatására szolgáló szerológiai vizsgálat. A specifikus antitestek kimutatására használt vizsgálatok érzékenysége azonban jelentősen eltér . Az 1-es vagy 2-es genotípusú antigéneken alapuló kereskedelmi diagnosztikai vizsgálatok nem képesek kimutatni a 3-as vagy 4-es genotípusú izolátumok elleni szérum antitesteket . Keveset tudunk a különböző diagnosztikai vizsgálatok nem megfelelőségének alapjául szolgáló mechanizmusokról.

jelenleg egy in vitro sejttenyésztési rendszer még mindig nem áll rendelkezésre a HEV kutatásához. Ezért a legtöbb immunogén helyet tartalmazó pORF2-t széles körben alkalmazták a HEV immunológiai vizsgálatához, konformációfüggő karakterrel . A semlegesítő és védő antitestek kiváltására szolgáló immunogén szerkezeti alapja a semlegesítő epitóp, amely a hepatitis E vakcina fejlesztésének fő célpontja . Korábban beszámoltunk arról, hogy a P166 fehérje, a porf2 csonka fehérje képes modellezni a HEV semlegesítő epitópokat, és a p166 ellen termelt antitestek kereszt-semlegesíthetik a HEV különböző genotípusait . Ezenkívül az 1. genotípusú HEV-ből származó hepatitis E p239 vakcina hatékony volt a kínai Jiangsu tartományban végzett 3. fázisú klinikai vizsgálatban, ahol a járványos HEV izolátum a 4 .genotípus. Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a HEV különböző genotípusain belül közös semlegesítő epitóp(ok) léteznek. A közös semlegesítő epitóp(ok) mellett a genotípus-specifikus epitóp(ok) létezését is megerősítették a mAb előkészítéséhez és jellemzéséhez .

a közös és genotípus-specifikus semlegesítő epitópok jellemzésének további azonosítása érdekében a Kompetitív gátlási vizsgálatot közös semlegesítő MABS, 3G1 és 5G5, valamint genotípus-specifikus semlegesítő MABS, 2B1 és 4C5 alkalmazásával hozták létre, hogy megvizsgálják a p166w01 vagy p166Chn antigénhez való versenykötődést, és meghatározzák, hogy a mAbs felismeri-e a független, hasonló vagy átfedő epitópokat.

kezdetben MABS 3G1, 2B1, 5G5 és 4C5 aszcitikus folyadékokat állítottak elő, tisztítottak és HRP-vel konjugáltak. Az ELISA módszert alkalmazták a HRP-konjugált MAB-k kötési Af-végességének összehasonlítására a HEV P166 különböző genotípusaival. Az eredmények azt mutatták, hogy a HRP-konjugát ed 2B1 csak az 1-es genotípussal reagált p166W01, de nem p166Chn. Hasonlóképpen, a HRP-konjugált 4C5 csak a p166Chn-rel reagált. Ezzel szemben a HRP-konjugált 3G1 és 5G5 jól reagált a 2 genotípusú p166 fehérjékkel szemben. Tehát a Kompetitív kötési vizsgálatok az 1-es és 4-es genotípusú HEV p166 antigéneken alapulnak. A versenyképes kötési vizsgálatok eredményei nem meglepőek, azaz. hogy a 2B1 p166w01-hez való kötődése csak önmagában versenyzett, míg a 3G1 és az 5G5 versenyezhetett egymással a p166w01-hez való kötésért. Ezenkívül a 4C5 p166chn-hez való kötődése hasonlóan csak önmagában versenyzett, de a 3G1 és az 5G5 versenyezhetett egymással a p166Chn-hez való kötésért. Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a 3G1 és az 5G5 azonos vagy átfedő epitópokat ismer fel, a 2B1 és a 4C5 pedig különböző epitópokat.

ez az első tanulmány, amely a HEV genotípus-közös és genotípus-specifikus konformációs semlegesítő epitópjainak különböző jellemzőit vizsgálja. Kimutattuk, hogy a közös és genotípus-specifikus semlegesítő epitópok függetlenek lehetnek. Ez a felfedezés nagyon hasznos a különböző diagnosztikai vizsgálatok alacsony konkordanciájának alapjául szolgáló mechanizmusok bemutatására. További vizsgálatok kulcsfontosságúak a HEV semlegesítő epitópjainak különböző jellemzőinek tisztázására a diagnosztikai fejlesztés és a vakcinakészítés hatékonyságában.

elismerés

ezt a munkát az Anhui Orvostudományi Egyetem doktori tudományos kutatási alapítványa támogatta (no.0110037101).

közzétételi nyilatkozat

A szerzők nem állapítanak meg összeférhetetlenséget.

szerző kapcsolatok

cikk / Kiadvány részletei

szerzői jog / kábítószer-adagolás / jogi nyilatkozat

szerzői jog: Minden jog fenntartva. A kiadvány egyetlen része sem fordítható le más nyelvekre, reprodukálható vagy felhasználható bármilyen formában vagy eszközzel, elektronikus vagy mechanikus, beleértve a fénymásolást is, felvétel, mikrokópia, vagy bármilyen információtároló és visszakereső rendszerrel, a kiadó írásbeli engedélye nélkül.
gyógyszeradagolás: a szerzők és a kiadó minden erőfeszítést megtettek annak biztosítására, hogy a jelen szövegben meghatározott gyógyszerkiválasztás és adagolás összhangban legyen a közzététel időpontjában érvényes ajánlásokkal és gyakorlattal. Tekintettel azonban a folyamatban lévő kutatásokra, a kormányzati szabályozások változásaira, valamint a gyógyszeres terápiával és a gyógyszerreakciókkal kapcsolatos folyamatos információáramlásra, az olvasót arra kérjük, hogy ellenőrizze az egyes gyógyszerek betegtájékoztatóját a javallatok és az adagolás bármilyen változása, valamint a további figyelmeztetések és óvintézkedések szempontjából. Ez különösen fontos, ha az ajánlott szer egy új és / vagy ritkán alkalmazott gyógyszer.
jogi nyilatkozat: A jelen kiadványban szereplő nyilatkozatok, vélemények és adatok kizárólag az egyes szerzőké és közreműködőké, nem pedig a kiadóké és a szerkesztőké. A reklámok és/vagy termékhivatkozások megjelenése a kiadványban nem jelenti a reklámozott termékek vagy szolgáltatások szavatosságát, jóváhagyását vagy jóváhagyását, illetve azok hatékonyságát, minőségét vagy biztonságát. A kiadó és a szerkesztő(k) kizárják a felelősséget a tartalomban vagy a hirdetésekben említett ötletekből, módszerekből, utasításokból vagy termékekből eredő személyi vagy vagyoni károkért.