Clostridium difficile toxin B

amikor a glükóziltranszferáz katalitikus treonin maradéka deaktiválja a kis Gtpázok családját, például a Rho családot; a RAC és a Cdc42 a célsejtekben megzavarják a jelátviteli mechanizmusokat, ami az aktin citoszkeleton diszfunkciójához, a sejt-sejt csomóponthoz és az apoptózishoz vezet (ábra. 5). A Rho indukálja az aktin stresszrostok aktivitását. A RAC fehérjék szabályozzák a membrán fodrozódását és a NADPH-oxidáz neutrofil aktivitását. A Cdc42 szabályozza az F-aktin szálképződést a filopódiában.

Citotoxicitásszerkesztés

3. ábra: A B Toxin megváltoztatja a sejtszerkezet dinamikáját. A sem képei: a) kontroll sejtek és b) tcdb-vel kezelt sejtek 18 órán keresztül. Fekete nyíl jelzi a helyét a sejt felületén blabbing.

számos tanulmány kimutatta, hogy a tcdb jelenléte emlős sejtekben gyors változásokhoz vezet a sejtmorfológiában és a sejtjelzésben. Rövid időn belül a sejtek kis mennyiségű tcdb-vel és TcdA-val rendelkeznek. Ezenkívül a sejtek halála ezeknek a toxinoknak a fő hatása a sejtek mérgezése után. A Donta által végzett vizsgálat et al., továbbította, hogy a TcdB súlyos hatással van más emlős sejtekre, például kínai hörcsög petefészek sejtekre, humán nyaki hámsejtekre, egér mellékvese sejtekre, patkány hepatocitákra és patkány asztrocitákra (ábra.3).

a citotoxikus aktivitás a sejttípusokon alapul, amelyek a 4-szeres és a 200-szoros között mozoghatnak. Általában, amikor a sejteket tcdb-vel fertőzik meg, nemcsak elveszítik szerkezeti integritásukat, hanem az F-aktin szálak csökkenését is. A tcdb-vel végzett cellakerekítés nem tart tovább, mint 2 óra (ábra. 4), de amennyire a sejthalál megy, körülbelül 24 órát vehet igénybe. Ami a Clostridium difficile-hez társuló hasmenést (CDAD) illeti, a citopátia hatásai kritikusabbak, mint a tényleges sejthalál, mert ha a sejtek elveszítik a citoszkeleton aktinszál integritását, elveszítik normális működését is.

4. ábra: A B Toxin hatása a patkány asztrocitákra. Ez egy valószínű illusztráció a patkány asztrocitákról, amelyeket 100 ng/ml B toxinnal inkubáltak 2 órán át 37 Kb.

ennek a szakasznak a ténybeli pontossága vitatott. Releváns vita megtalálható a Talk oldalon:Clostridium difficile toxin B. kérem, segítsen biztosítani a vitatott állítások megbízható forrását. (2013. június) (Ismerje meg, hogyan és mikor távolíthatja el ezt a sablonüzenetet)

a tcdb citotoxikus aktivitásának oka a gazdasejtben elsősorban receptor endocitózis útján közvetíti. A savas endoszómák lehetővé teszik a B toxin bejutását a citoszolba. Ezt a jelenséget egy kötő receptor régió hajtja végre, amely lehetővé teszi a toxin bejutását a gazdasejtekbe. A gazdasejtek citoszoljának hozzáférhetősége révén a TcdB deaktiválja a kis Gtpázokat (ábra. 5), pl. a Rho család tagjai Rac és Cdc42 a treonin 35 cdc42-ben és Rac-ban és treonin 37 Rho-ban történő glikozilezésével. Ezek a Rho Gtpázok mindenütt megtalálhatók az eukarióta sejtek citoszoljában, amelyek felelősek az aktin citoszkeleton szervezéséért, mivel a citoszolban lévő toxinok az aktinszálak kondenzációját okozzák a sejtek kerekítése és a membrán blabbing következtében (ábra. 3), ami végül apoptózishoz vezet. A TcdB kritikus változásokat okoz a sejtdinamikában és a morfológiában. A 3. ábra A B toxin valószínű hatását mutatja a sejt felületére; membrán blabbing (fekete nyilak). Ezenkívül a TcdB inaktiválja a Rho Gtpázokat. Ennek következtében a sejt-sejt csomópontok megszakadnak, ami fokozza a toxin B epiteliális permeabilitását és a folyadék felhalmozódását a lumenben. Ez az egyik fő kórokozó a Clostridium difficile-hez társuló hasmenés (CDAD) megkötésében(ábra. 5).

5. ábra: intracelluláris módosítások a TcdB által. Először is, a B Toxin a sejt felszínéhez kötődik, és receptor által közvetített endocitózissal internalizálódik. Másodszor, az endoszóma savanyítása olyan pórus képződését váltja ki, amelyen keresztül a GTD transzlokálódik. Harmadszor, az UDP-glükóz felvétele elősegíti a Gtpázokhoz való kötődést és a citoszolba történő felszabadulást. Végül a GTD glükozilálja a Rho család Gtpázjait a sejtmembránon, és szabályozza a transzkripció szabályozását és végül a sejt apoptózisát.

ezenkívül az UDP-glükóz tcdb általi hidrolízisének sebessége körülbelül ötszöröse a TcdA-nak. Számos tanulmány kimutatta, hogy a Rho poszttranszlációs módosítást mutat prenilezés és karboximetilezés révén, amely a plazmamembrán citoplazmatikus oldalán történik, így a GTP cseréje a GDP-re. Amikor a TcdB kötődik az Rho-hoz és más kis Gtpázokhoz, a GTP hidrolizál a GDP-hez, ami a GTP-hez kötött (aktív) a GDP-hez kötött (inaktív) (ábra. 5). Ezenkívül ezt a csereaktivitást guanin faktorok szabályozzák a sejt citoszoljában.

zavar a jelútvonalakon

a Rho, a Rac és a Cdc42 sejtszabályozása a citoszkeleton aktinszálainak közelében kívül is hatással van (ábra. 4), Ezek a kis Gtpázok beépülnek a sejtciklusba, amely mitogén-aktivált protein-kináz-kinázokon (MAPKKs) keresztül szabályozza a jeleket. A sejtek egyes fiziológiai részei, amelyek nem vesznek részt az aktinszálakban, nem okozhatnak sejt kerekítést vagy sejthalált azonnal, de a downstream útvonal aktivitásában az aktinszálak romlásához, végül sejthalálhoz vezethetnek.

1993-ban shoshan et al., kimutatta, hogy a tcdb-vel rendelkező sejtek megváltoztatták a foszfolipáz A2 aktivitását. Ez független esemény volt az aktin citoszkeleton megzavarásától. Shoshan et al., azt is kimutatta, hogy a TcdB gátolta a receptor jelátviteli aktivitását azáltal, hogy a Rho fehérjéket foszfolipáz d-n keresztül deaktiválta.

Pórusképződésedit

a TcdB a clathrin által közvetített endocitózison keresztül jut be a sejt belsejébe, amikor a B toxin a citoszol része, a glükozil-transzferáz áthalad az endoszomális membránon, ami csökkenti a pH-t, transzlokációt indukál, végül a transzlokációs régió maradványainak morfológiai változásaihoz vezet (958-1130). A hidrofób régiók be vannak ágyazva a gazdamembránba, hogy pórusokat képezzenek, amelyek lehetővé teszik a glükozil-transzferáz domének áthaladását. Amikor a sejteket savas környezetben TcdB-vel fertőzik meg, gyengíti a toxinokat, és alakváltozásokat okoz (ábra. 6). A savas pH következtében a TcdB egyértelmű különbségeket mutat a triptofán eredeti fluoreszcenciájában, a proteázok érzékenységében és a hidrofób felületekben. Egy másik csoport kimutatta, hogy a savasodás a toxin konformációs változásaihoz vezet, és ami még fontosabb, segít a pórusok kialakításában. Egy feltételezett transzlokációs régió (ábra. 2) körülbelül 801-1400 aminosavat alkot, amelyekből a 958-1130 maradványok hidrofób jellegűek, és felelősek a transzmembrán pórusok kialakulásáért. A vizsgálatok többsége a tcdb 630 törzset használta a C. difficile toxinok pórusképző aktivitásának bemutatására.

által indukált pHEdit

annak megállapítására, hogy a tcdb proteolitikus hasítása a sejtfelszínen vagy savas endoszómákban történik-e, a vizsgálatokban Bafilomicin A1-et alkalmaztak, amelyről ismert, hogy blokkolja az endoszómák v-típusú H+ – Atpázjait. Ez csökkenti az endoszómák savasságát. A tcdb fiziológiai felvételi útja megakadályozza a tcdb citopátiás aktivitását. Amikor a sejtek savas körülmények között (pH 4,0) voltak 5 percig, miután a TcdB-t a sejtfelszínhez kötötték 37 Celsius fokon, az alak átrendeződését és kerekítését figyelték meg. Amikor azonban a lekerekített sejteket további egy órán át inkubáltuk semleges pH-n (7,0), hasonló paraméterekkel, a sejtek kerekítését nem figyelték meg. Mindkét tanulmány kimutatta, hogy a B toxin proteolitikus hasítással rendelkezik, ami kritikus a citoszolhoz való hozzáférés szempontjából. A savas endoszóma pH-ja a TcdB topológiai változásaihoz vezet (6.ábra).

6. ábra: a TcdB szervezeti területe.A semleges és a savas pH közötti különbség (4).

GeneticsEdit

a tcdb fehérjét kódoló gén, a tcdB a 19,6 kb-os kromoszómális régióban található. Ezt nevezik patogenitási lokusznak vagy PaLoc-nak (2.ábra). A tcdb nyitott olvasókeret (ORF) hossza 7098 nukleotid. Fontos megemlíteni—hogy-a PaLoc régió fő toxingénjein kívül-három másik kiegészítő gén is kódol a PaLoc régióban: tcdR (L), tcdc (R) és tcde középen. Ezek a gének segítik a TcdA és TcdB expresszió szabályozását. Segítenek a toxinok kiválasztásában vagy felszabadításában a sejtből. A tcdb és a tcdA között elhelyezkedő tcde kódoló gén analóg a holin fehérjékkel, ezért feltételezhető, hogy a tcdE facilitátor génként működik, amely fokozza a tcda és a TcdB felszabadulását vagy szekrécióját, következésképpen növeli a gazdasejt membrán permeabilitását.

2. ábra: archetipikus patogenitási lokusz (PaLoc), amely a C-ben részt vevő nagy clostridialis toxinokat(LCT-ket) kódolja. difficile fertőzések CDI.

a C. difficile különböző plazmidméretei vannak. A detektált molekulatömegek 2, 7×106-tól 100×106-ig terjednek, de a plazmidméretek nem mutatnak összefüggést a toxicitással. A C. difficile toxin B szintjének kimutatása érdekében a klinikusok széles körben használják a PMC-ben szenvedő betegek székletmintáiból származó sejttenyészet-vizsgálatokat. A sejttenyésztési vizsgálatot “arany standardnak” tekintik a toxicitás kimutatására a C. difficile-ben, mivel kis mennyiségű B toxin képes a sejtek kerekítésére (ábra. 4), így a klinikai laboratóriumok egyik fő előnye, hogy korrelációkat hoznak létre a TCDB által okozott CDAD-vel. Bár a nagy klostridialis toxinok (LCT-k) citotoxikus aktivitását a PMC beteg székletmintáiban találták, a B toxin aktivitása károsabb citotoxikus hatást fejtett ki az a toxinhoz képest. ezért az a toxin aktivitása gyengül, ha nem izolálják a B toxinból. a C. difficile toxicitás kimutatása rendkívül érzékeny, azonban a sejttenyésztési vizsgálat segítségével a klinikai laboratóriumok leküzdhetik a kihívást; 1 pg/mL toxin B dózis használata elegendő a sejtek kerekítéséhez. Ez a fő előnye a tenyészszövet-vizsgálat alkalmazásának a toxicitás kimutatására PMC-ben szenvedő betegeknél. Annak ellenére, hogy a klinikai laboratóriumok megpróbáltak egy mikrotiter lemez enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálatot (ELISA) és más technikákat alkalmazni a toxin B citotoxikus aktivitásának kimutatására a PMC betegek székletében, az eredmények nem olyan pontosak, mint azok, ahol sejttenyésztési vizsgálatokat alkalmaztak.

termelési faktorhitel

antimikrobiális szerek hozzáadásával, pl. a klindamicin, a tenyészet táptalajába, tanulmányok kimutatták, hogy a C. difficile tenyészetekben a citotoxikus aktivitás 4-8-szorosára nő. Sőt, ismerve az antibiotikumok szerepét a PMC okaiban, számos korábbi tanulmány az antimikrobiális szerek toxinok termelésének hatásaira összpontosított. Ennek eredményeként a vizsgálatok arra a következtetésre jutottak, hogy a vankomicin és a penicillin szint szubinhibitorikus jellege növeli a toxintermelést a C. difficile tenyészetekben. A toxintermelés mennyisége korrelált az organizmusok táptalajának használatával. Egy másik tanulmány azt illusztrálta, hogy a tcdb toxintermelésének magas szintjét olyan komplex médiumokban figyelték meg, mint az agy és a szív infúziós húsleves. Nagy mennyiségű toxin termelődött izolálása erősen virulens. Ezzel szemben a toxinok alacsony szintjét gyengén virulens izolálással állították elő. Így azt mutatja, hogy a toxinok termelését társszabályozták. Bár a toxinokat kifejező jelek modulálásában a környezet szerepe mögött meghúzódó mechanizmus nem ismert, in vitro vizsgálatok kimutatták, hogy a toxin expresszióját erősíti a katabolit elnyomás és a stressz, például az antibiotikumok. Egy másik tanulmány kimutatta, hogy a biotin jól jellemzett közegben történő korlátozása a TcdB termelését 64-szeresére, a TcdA-t pedig 35-szörösére növeli. Ez történt a C. difficile és adag biotin olyan kicsi, mint 0,05 nM. Számos más korai tanulmány azzal érvelt, hogy a toxin termelésének bármi köze van a stresszhez vagy a tcda vagy a tcdb toxin katabolit elnyomásához. Számos tanulmány szerint a többi vizsgálat közötti különbségek fő oka az, hogy a toxintermelés nem fordul elő a C. difficile összes izolátumánál.