epe-Esculin teszt az enterococcusok és streptococcusok feltételezett azonosítására: az Epekoncentráció, az Inokulációs technika és az inkubációs idő hatásai

a kataláz-negatív, alfa-hemolitikus és nem-hemolitikus gram-pozitív coccusok felismerése és differenciálása párokban és láncokban enterococcusként; a D csoportú streptococcusok (főleg a bovis); és a nem D csoportú viridans csoport streptococcusai klinikailag fontosak (10). Az epe-esculin tesztet széles körben használják az enterococcusok és a D csoportú streptococcusok megkülönböztetésére, amelyek epe toleránsak és hidrolizálhatják az eszkulint esculetinre, a nem D csoportú viridans csoportú streptococcusoktól, amelyek rosszul növekednek az epén. Először 1926-ban Meyer és Schonfeld (8) írták le, az epe-esculin tesztet Facklam és Moody (2, 3, 5) 100% – os érzékenységgel és 97% – os specifitással igazolták az enterococcusok és a D csoportba tartozó streptococcusok azonosítására. Ezeket az eredményeket 4% oxgallt (epesókat) tartalmazó agar-ferdékkel kaptuk, 1 vagy 2 csepp 24 órás Todd-Hewitt-vel oltottuk be a szervezet mindkét tenyészetét (“másnap” oltás), és 48 órán át inkubáltuk. a rutin diagnosztikai bakteriológiában egy ilyen protokoll nem praktikus, mivel 3 napot igényel attól az időponttól kezdve, amikor a telepeket az elsődleges lemezeken kimutatják. A legtöbb tankönyv és eljárási kézikönyv azt javasolja, hogy az agar-lejtőket közvetlenül néhány kolóniából (“aznapi” oltás) oltsák be, nem pedig a húsleves 24 órás szubkultúrájából, de hiányoznak az ezt a nem szabványos alternatív technikát alátámasztó adatok.

ezért az epe-esculin teszt érzékenységét és specifikusságát két különböző módszerrel (standardizált és nem standardizált) és két különböző inkubációs idővel (24 és 48 óra) értékeltük. Összehasonlítottuk a 2 és 4% oxgallt tartalmazó esculin Slant-okat az Egyesült Államokban jelenleg két nagy kereskedelmi forrásból származó készítményekben.

kataláz-negatív, gram-pozitív cocci párokban és láncokban alfa-hemolitikus vagy nem hemolitikus kolóniákat képezve 5% juh vér agaron, amelyek pozitívak voltak PYR-re (Murex, Dartford , Egyesült Királyság), és 6,5% NaCl-t tartalmazó triptikus szójalevesben nőttek (Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, Md.) enterococcusként azonosították őket; az API Rapid Strep rendszerrel (biominitivrieux Vitek, Hazelwood, Mo.). Kataláz-negatív, gram-pozitív cocci párokban és láncokban alfa-hemolitikus vagy nemhemolitikus kolóniákat képezve, amelyek negatívak voltak a PYR-re, nem növekedtek 6,5% NaCl-ban, pozitívak voltak a D csoport antigénjére latex agglutinációval (Murex), és szuggesztív (90% – os valószínűségű) biokémiai mintázattal rendelkeztek az API Rapid Strep rendszer szerint S. bovis-ként azonosították. Kataláz-negatív, gram-pozitív cocci párokban és láncok alkotó alfa-hemolitikus vagy nonhemolytic kolóniák, amelyek negatívak voltak a PIR és a D csoport antigén (és oldhatatlanok voltak az epében, ha alfa-hemolitikus), az úgynevezett viridans csoport streptococcusok.

Összesen 110 Enterococcus törzset (34 Enterococcus faecalis, 15 Enterococcus faecium és 61 nem hemolitikus és nem specifikus törzs), 30 S. bovis törzset (2 alfa-hemolitikus és 28 nem hemolitikus törzs) és 110 nem D csoportba tartozó viridans Streptococcus törzset (83 alfa-hemolitikus és 27 nem hemolitikus törzs) vizsgáltak. A törzseket egymás után izoláltuk a Duke Egyetem Orvosi Központjában végzett vérkultúrákból egy 4 éves időszak alatt, kivéve 19 S. bovisstrains amelyeket a Mayo klinikából nyertek.

friss (24-h) baktériumokat oltottunk be három különböző esculin agarra, amelyek vagy nem tartalmaznak epét (BDMS), 2% oxgallt (20% epének felel meg) (BDMS) vagy 4% oxgallt (40% epének felel meg) (Remel, Lenexa, Kans.). Oxgall kivételével a három média összetétele azonos volt. Minden táptalajra a következő két oltási technikát alkalmaztuk: (i) 1-10 kolónia közvetlen, nem standardizált S-alakú beoltása és (ii) 10 db 0,5 McFarland standard baktérium szuszpenzió közvetett, standardizált beoltása steril ionmentesített vízben. A ferdéket 35cc-on inkubáltuk környezeti levegőben (2) laza kupakkal 48 órán át. a leolvasásokat 24 és 48 órán keresztül vettük. a reakciót pozitívnak tekintették, ha a tápközeg felét vagy annál többet megfeketítették (4).

egy kivétellel mind a 110 Enterococcus törzs egyértelműen pozitív reakciót adott 24 és 48 órás inkubáció után (99%-os érzékenység). A standardizált inokulum (körülbelül 106 CFU) ugyanolyan érzékeny volt, mint a nehezebb, nem szabványosított inokulum. Facklam és Moody, 107-108 CFU inokulumot használva agar slantokon, 100%-os érzékenységről számoltak be 48 óra elteltével, de 2 76 (5) és 6 157 (3) Enterococcus törzset találtak epe-esculin negatívnak (98% – os érzékenység) 24 órás inkubálás után. A Swan (13) egy nem standardizált inokulum felhasználásával, amelyet nehéznek, valamint agar lemezeknek neveztek, amelyeken bármilyen feketedést pozitív eredménynek tekintettek, 100% – os érzékenységet kapott 24 órán keresztül 121 Enterococcus törzsnél. Ennek ellenére a Facklam publikációi alapján a legtöbb tankönyv és eljárási kézikönyv 48 órás inkubációt javasol, mielőtt negatív eredményt jelentene.

az S. bovis mind a 30 törzse 24 és 48 órán át pozitív volt, függetlenül az epekoncentrációtól vagy az oltás módjától (100% – os érzékenység). A Facklam (3) 94, illetve 100% – os érzékenységet jelentett 24, illetve 48 óra elteltével, 37 D csoportú Streptococcus törzsnél.

az 1.táblázat tartalmazza a hamis pozitív epe-eszkulin tesztek százalékos arányát 110, A D csoportba nem tartozó viridans csoportba tartozó streptococcus törzs esetében. Megállapítottuk, hogy a specificitás (100% mínusz a százalékos hamis pozitív) maximális volt (97%) 4% oxgallt tartalmazó agar ferdén csíkos standardizált inokulummal, amelyet 24 óra után olvastunk. hamis pozitív eredményeket kaptunk két Streptococcus milleriés egy Streptococcus lactis subsp. diacetilaktiszstrainek. Az inokulum szabványosításának hiánya, az oxgall koncentrációjának csökkenése 2% – ra, az inkubációs idő meghosszabbítása 48 órára növelte a hamis pozitív eredmények számát legfeljebb 24% – ra. A korábbi vizsgálatok során a szelektív esculin agar-agart tartalmazó nátrium-azid, s csak 10% – epe, a pozitív reakciók, nem ” D ” csoport viridans csoport streptococcus volt gyakori (6, 11, 12). Nincs adat a használata tartalmazó adathordozó 2% oxgall már megjelent korábban. Eredményeink azt sugallják, hogy ez a koncentráció nem optimális. Használata 4% oxgall, Hattyú (13) talált két epe-toleráns viridans csoport streptococcus törzsek 21 izolátumok; sem a törzs azonban, hidrolizált esculin 24 h. Facklam et al. jelentett sajátosságait, 99% 24 h (3) 81 a (4) – 97% – át (3) a 48., h 4% oxgall.

feltűnő különbséget találtak, amikor az alfa-hemolitikus és a nem hemolitikus, Nem D csoportba tartozó viridánok streptococcusainak alcsoportjait hasonlították össze a hamis pozitív eredmények számában. Az alfa-hemolitikus törzsek esetében ez a szám 0% volt 24 óra után és 3% 48 óra után, míg a nem hemolitikus törzsek esetében 11% volt 24 óra után és 33% 48 óra után, 4% oxgall és standardizált inokulum (P = 0,017 a 24 órás értékekhez; Kétfarkú Fisher-féle pontos teszt). Ilyen megfigyelésről korábban nem számoltak be.

a véren és általában steril helyeken kívüli minták esetében az epe-esculin teszten alapuló folyamatábra 6,5% NaCl toleranciával vagy PYR jelenléttel kombinálva elegendő az enterococcusok megbízható azonosításához. A vérből és általában steril helyekről származó epe-esculin-pozitív organizmusokat meg kell határozni. Az enterococcusok speciációja epidemiológiai okokból hasznos, mivel az E. faecium és más fajok általában ellenállóbbak az antibiotikumokkal szemben, mint az E. faecalis (8, 9). A végleges azonosítása. a bovis fontos, mivel a szervezet vastagbél-karcinómával társul, amelyet ilyen betegeknél ki kell zárni (7). Másrészről, hamis pozitív jelentések ofS. a bovis szükségtelen vizsgálatokhoz vezethet. Az epe-esculin-pozitív organizmusok specifikációja lehetővé teszi a hamis pozitív, Nem D csoportba tartozó viridánok streptococcusok kimutatását is. Terápiás hibák fordulhatnak elő a streptococcusok és enterococcusok téves azonosításával (1). Az epe-esculin-negatív organizmusok rutinszerű speciációja nem szükséges, mivel az enterococcusok és a D csoportba tartozó streptococcusok ritkán adnak hamis negatív reakciókat.

Összefoglalva, az epe-esculin teszt jól működik az enterococcusok és a D csoportú streptococcusok gyors elválasztására a nem D csoportú viridans csoportú streptococcusoktól alacsony költséggel és jó érzékenységgel (>99%) és specifitással (97%), feltéve, hogy 40% epét tartalmazó agar ferdén hajtják végre, standardizált inokulummal (10 ml 0,5 McFarland standard baktériumszuszpenzióval), és 24 órán belül leolvasható.