Fehérje Tisztítás
a kiindulási anyag kiválasztása kulcsfontosságú a tisztítási folyamat megtervezéséhez. Egy növényben vagy állatban egy adott fehérje általában nem oszlik el homogén módon a testben; a különböző szervekben vagy szövetekben magasabb vagy alacsonyabb a fehérje koncentrációja. Csak a legmagasabb koncentrációjú szövetek vagy szervek használata csökkenti az adott mennyiségű tisztított fehérje előállításához szükséges mennyiségeket. Ha a fehérje alacsony mennyiségben van jelen, vagy ha magas az értéke, a tudósok rekombináns DNS-technológiát alkalmazhatnak olyan sejtek kifejlesztésére, amelyek nagy mennyiségű kívánt fehérjét termelnek (ezt expressziós rendszernek nevezik). A rekombináns expresszió lehetővé teszi a fehérje címkézését, például egy His-tag vagy Strep-tag segítségével a tisztítás megkönnyítése érdekében, csökkentve a szükséges tisztítási lépések számát.
az analitikai tisztítás általában három tulajdonságot használ a fehérjék elválasztására. Először a fehérjéket izoelektromos pontjaik szerint tisztíthatjuk úgy, hogy pH-besorolású gélen vagy ioncserélő oszlopon futtatjuk őket. Másodszor, a fehérjék méretük vagy molekulatömegük szerint elválaszthatók méretkizárási kromatográfiával vagy SDS-PAGE (nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélelektroforézis) elemzéssel. A fehérjéket gyakran 2D-oldal használatával tisztítják, majd peptidtömeg-ujjlenyomattal elemzik a fehérje azonosságának megállapításához. Ez nagyon hasznos tudományos célokra, és a fehérje kimutatási határértékei manapság nagyon alacsonyak, és nanogramm mennyiségű fehérje elegendő az elemzéshez. Harmadszor, a fehérjéket polaritással/hidrofóbitással lehet elválasztani nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával vagy fordított fázisú kromatográfiával.
a fehérjetisztítási protokoll általában egy vagy több kromatográfiás lépést tartalmaz. A kromatográfia alapvető eljárása az, hogy a fehérjét tartalmazó oldatot különféle anyagokkal töltött oszlopon átfolyatják. A különböző fehérjék eltérően kölcsönhatásba lépnek az oszlop anyagával, így elválaszthatók az oszlop áthaladásához szükséges idővel vagy a fehérje eluálásához szükséges feltételekkel. Általában a fehérjéket 280 nm-es abszorbanciájukkal detektálják, amikor az oszlopról kijönnek. Számos különböző kromatográfiás módszer létezik:
méret kizárás chromatographyEdit
a kromatográfiával porózus gélek alkalmazásával elválaszthatók a fehérjék oldatban vagy denaturálási körülmények között. Ezt a technikát méretkizárási kromatográfiának nevezik. Az elv az, hogy a kisebb molekuláknak nagyobb térfogatot kell áthaladniuk egy porózus mátrixban. Következésképpen egy bizonyos tartományú fehérjék változó térfogatú eluenst (oldószert) igényelnek, mielőtt a géloszlop másik végén összegyűjtenék őket.
a fehérjetisztítás összefüggésében az eluenst általában különböző kémcsövekben egyesítik. Minden kémcsövet, amely nem tartalmaz mérhető nyomot a fehérjéből a tisztításhoz, eldobjuk. A maradék oldat így a tisztításhoz szükséges fehérjéből és bármely más hasonló méretű fehérjéből készül.
töltésen vagy hidrofóbián alapuló elválasztás
hidrofób kölcsönhatás kromatográfiaszerkeszt
a HIC közeg amfifil, mind hidrofób, mind hidrofil régiókkal, lehetővé téve a fehérjék felszíni hidrofóbitásuk alapján történő elválasztását. A célfehérjék és termékük összesített fajai általában eltérő hidrofób tulajdonságokkal rendelkeznek, és a HIC-n keresztül történő eltávolításuk tovább tisztítja a kérdéses fehérjét. Ezenkívül az alkalmazott környezet általában kevésbé kemény denaturáló körülményeket alkalmaz, mint más kromatográfiás technikák, így segít megőrizni a kérdéses fehérjét natív és funkcionális állapotában. Tiszta vízben a gyanta és a fehérje hidrofób régiói közötti kölcsönhatások nagyon gyengék lennének, de ezt a kölcsönhatást fokozza, ha fehérjemintát viszünk fel a HIC gyantára nagy Ionos szilárdságú pufferben. A puffer Ionos szilárdságát ezután a csökkenő hidrofóbitás sorrendjében elute fehérjékké redukáljuk.
ioncserélő kromatográfiaszerkesztés
az ioncserélő kromatográfia az ionos töltésük jellege és mértéke szerint választja el a vegyületeket. A használandó oszlopot a töltés típusa és erőssége szerint választják ki. Az anioncserélő gyanták pozitív töltéssel rendelkeznek, és negatív töltésű vegyületek (anionok) megtartására és elválasztására szolgálnak, míg a kationcserélő gyanták negatív töltéssel rendelkeznek, és a pozitív töltésű molekulák (kationok) elválasztására szolgálnak.
az elválasztás megkezdése előtt puffert pumpálnak át az oszlopon, hogy kiegyenlítsék az ellentétes töltésű ionokat. A minta befecskendezésekor az oldott anyagmolekulák cserélődnek a pufferionokkal, mivel mindegyik versenyez a gyanta kötőhelyeiért. Az egyes oldott anyagok visszatartásának hossza a töltés erősségétől függ. A leggyengébb töltésű vegyületek először eluálódnak, majd azok, amelyek egymás után erősebb töltéssel rendelkeznek. Az elválasztó mechanizmus jellege miatt a pH, a puffer típusa, a pufferkoncentráció és a hőmérséklet mind fontos szerepet játszanak az elválasztás szabályozásában.
az ioncserélő kromatográfia nagyon hatékony eszköz a fehérjék tisztításához, és gyakran használják mind az analitikai, mind a preparatív szeparációkban.
szabad áramlású elektroforézis
szabad áramlású elektroforézis (FFE) egy hordozómentes elektroforézis technika, amely lehetővé teszi preparatív fehérje elválasztás lamináris pufferáramban ortogonális elektromos mező alkalmazásával. PH-gradiens alkalmazásával, amelyet például ampholyták indukálhatnak, ez a technika lehetővé teszi a fehérje izoformák elválasztását < 0,02 delta-pI felbontásig.
Affinitáskromatográfiaszerkesztés
az affinitás kromatográfia molekuláris konformáción alapuló elválasztási technika, amely gyakran alkalmaz alkalmazásspecifikus gyantákat. Ezeknek a gyantáknak a felületéhez ligandumok kapcsolódnak, amelyek specifikusak az elválasztandó vegyületekre. Leggyakrabban ezek a ligandumok az antitest-antigén kölcsönhatásokhoz hasonló módon működnek. Ez a” lock and key ” illeszkedik a ligandum és a célvegyület közé, ami nagyon specifikussá teszi, gyakran egyetlen csúcsot generál, míg a mintában minden más nem található meg.
sok membránfehérje glikoprotein, és lektin affinitás-kromatográfiával tisztítható. A mosószerrel oldott fehérjék megengedhetők, hogy kötődjenek egy kromatográfiás gyantához, amelyet úgy módosítottak, hogy kovalensen csatolt lektinje legyen. Azokat a fehérjéket, amelyek nem kötődnek a lektinhez, lemossák, majd a specifikusan megkötött glikoproteinek eluálhatók magas koncentrációjú cukor hozzáadásával, amely a lektin kötőhelyén versenyez a kötött glikoproteinekkel. Egyes lektinek nagy affinitással kötődnek a glikoproteinek oligoszacharidjaihoz, amelyek nehezen versenyeznek a cukrokkal, és a kötött glikoproteineket a lektin denaturálásával kell felszabadítani.
Immunoaffinitás kromatográfiaszerkesztés
az Immunoaffinitás kromatográfia egy antitest-antigén specifikus kötődését használja a célfehérje szelektív tisztítására. Az eljárás magában foglalja a fehérje szilárd szubsztrátumhoz (például porózus gyöngyhöz vagy membránhoz) történő rögzítését, amely ezután szelektíven megköti a célt, miközben minden más átfolyik. A célfehérje eluálható a pH vagy a sótartalom megváltoztatásával. Az immobilizált ligandum lehet antitest (például immunglobulin G) vagy fehérje (például a fehérje). Mivel ez a módszer nem foglalja magában a címke tervezését, természetes forrásokból származó fehérjékhez használható.
címkézett fehérje Tisztításaedit
a fehérjék címkézésének másik módja az, hogy antigénpeptidcímkét készítünk a fehérjére, majd megtisztítjuk a fehérjét egy oszlopon vagy immobilizált antitesttel bevont laza gyantával inkubáljuk. Ezt az eljárást immunprecipitációnak nevezik. Az immunprecipitáció meglehetősen képes rendkívül specifikus interakció létrehozására, amely általában csak a kívánt fehérje kötődését eredményezi. A tisztított címkézett fehérjék ezután könnyen elválaszthatók az oldatban lévő többi fehérjétől, majd később tiszta oldattá eluálhatók.
ha a címkékre már nincs szükség, proteáz segítségével le lehet hasítani őket. Ez gyakran magában foglalja a proteáz hasítási helyének megtervezését a címke és a fehérje között.
HPLCEdit
a nagy teljesítményű folyadékkromatográfia vagy a nagynyomású folyadékkromatográfia a kromatográfia egyik formája, amely nagy nyomáson hajtja végre az oldott anyagokat az oszlopon gyorsabban. Ez azt jelenti, hogy a diffúzió korlátozott, és a felbontás javul. A leggyakoribb forma a” fordított fázisú ” HPLC, ahol az oszlop anyaga hidrofób. A fehérjéket növekvő mennyiségű szerves oldószer, például acetonitril gradiensével eluáljuk. A fehérjék hidrofóbitásuk szerint eluálódnak. HPLC-vel történő tisztítás után a fehérje olyan oldatban van, amely csak illékony vegyületeket tartalmaz, és könnyen liofilizálható. A HPLC-tisztítás gyakran a tisztított fehérjék denaturálódását eredményezi, ezért nem alkalmazható olyan fehérjékre, amelyek nem spontán újrafoldódnak.